摘要
革蘭氏陰性菌嗜麥芽窄食單胞菌生存于多種生態(tài)位。由于其強(qiáng)大的生物膜形成能力和對多種抗生素的耐藥性，該菌也是一種醫(yī)院感染病原體，對免疫系統(tǒng)受抑制或受損的患者健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。除了組氨酸激酶RpfC，雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（TCS）是大多數(shù)細(xì)菌病原體使用的典型調(diào)控機(jī)制，但從未在嗜麥芽窄食單胞菌中進(jìn)行過實(shí)驗(yàn)研究。在此，我們在嗜麥芽窄食單胞菌基因組中注釋了62個推定的組氨酸激酶基因，并通過系統(tǒng)性插入失活成功獲得了51個突變體。表型鑒定發(fā)現(xiàn)了一系列在細(xì)菌生長、游動能力和生物膜形成方面存在缺陷的突變體。一個TCS，在此命名為BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208），被遺傳學(xué)證實(shí)可調(diào)控嗜麥芽窄食單胞菌中的生物膜形成。結(jié)合相互作用伙伴預(yù)測和染色質(zhì)免疫沉淀篩選，鑒定出六個在體內(nèi)被BfmA結(jié)合的候選啟動子區(qū)域。我們證明，其中BfmA作為一個轉(zhuǎn)錄因子，直接結(jié)合到bfmA-bfmK操縱子和Smlt0800（acoT）的啟動子區(qū)域，并正向調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄。acoT編碼一種與生物膜發(fā)育相關(guān)的?；o酶A硫酯酶。組氨酸激酶基因的基因組規(guī)模突變分析和BfmK-BfmA在生物膜中調(diào)控的功能解析，為支持更深入研究嗜麥芽窄食單胞菌的細(xì)胞信號傳導(dǎo)提供了遺傳信息，從而為開發(fā)抗擊這一重要細(xì)菌病原體的新方法奠定基礎(chǔ)。
組氨酸激酶（HKs）是大多數(shù)細(xì)菌用來檢測和響應(yīng)環(huán)境刺激的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（TCSs）的細(xì)胞傳感器。除少數(shù)細(xì)菌物種（如支原體屬）外，細(xì)菌細(xì)胞通常編碼幾個到數(shù)百個TCSs，其擁有的TCS總數(shù)是細(xì)菌適應(yīng)各種生態(tài)位能力的隱喻，即細(xì)菌的智商（IQ）。典型的TCS由一個膜結(jié)合的HK和一個細(xì)胞質(zhì)應(yīng)答調(diào)節(jié)因子（RR）組成。在監(jiān)測到特定刺激后，HK通過水解ATP使自身自動磷酸化，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到二聚化和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移（DHp）結(jié)構(gòu)域內(nèi)一個保守的組氨酸殘基上。接著，磷酸基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到其同源RR的N端接收器結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個保守天冬氨酸殘基上。此后，激活的RR根據(jù)其C端輸出結(jié)構(gòu)域的生化特性控制下游基因表達(dá)、細(xì)胞行為或酶活性。因此，細(xì)菌在復(fù)雜環(huán)境中生存的能力很大程度上取決于其HK庫的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和調(diào)控功能。在感染的背景下，一些HKs（例如PhoQ、QseC和SaeS）是細(xì)菌病原體毒力因子表達(dá)的典型調(diào)節(jié)因子。TCSs由原核生物、粘菌、真菌和植物的基因組編碼。然而，在動物的任何蛋白質(zhì)組中均未發(fā)現(xiàn)TCSs。因此，HK是開發(fā)針對細(xì)菌病原體的新型抗生素的潛在理想分子靶點(diǎn)。
在過去的30年里，革蘭氏陰性致病菌嗜麥芽窄食單胞菌已逐漸成為醫(yī)院中因免疫缺陷疾病或長期抗生素治療而免疫抑制患者的嚴(yán)重機(jī)會性病原體。這種病原體在此類免疫缺陷患者中引起致命性疾病，如肺炎、尿道炎、腦膜炎和血流感染。治療嗜麥芽窄食單胞菌感染的一個困難是，該菌的大多數(shù)分離株具有強(qiáng)大的生物膜形成能力，例如在輸液管、留置血管內(nèi)裝置、醫(yī)療器械、水管和宿主組織表面。這些細(xì)菌聚集體是感染源，并且很難有效清除。此外，嗜麥芽窄食單胞菌基因組編碼多種多藥外排泵和其他分子機(jī)制，增強(qiáng)了該菌對各種抗生素的耐藥性。由于這些原因，嗜麥芽窄食單胞菌已成為人類健康的嚴(yán)重威脅。一些研究估計(jì)，在報告的醫(yī)院感染病例中，高達(dá)77%的死亡率可能歸因于嗜麥芽窄食單胞菌感染。為了對抗嗜麥芽窄食單胞菌，基于靶向生物膜形成和毒力因子表達(dá)調(diào)控的新療法或抗菌劑的開發(fā)是可取的。然而，TCS調(diào)控作為可能被新型抗菌劑靶向的核心分子機(jī)制之一，在嗜麥芽窄食單胞菌中缺乏適當(dāng)?shù)难芯?。?shí)際上，只有HK RpfC（負(fù)責(zé)在近緣細(xì)菌黃單胞菌屬中調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊和毒力因子表達(dá)）被證明在嗜麥芽窄食單胞菌中控制擴(kuò)散信號因子（DSF）觸發(fā)的調(diào)節(jié)。我們之前的研究鑒定出FsnR，一個控制鞭毛基因轉(zhuǎn)錄和生物膜形成的孤兒RR，但FsnR的同源HK仍不清楚。
在本研究中，我們對嗜麥芽窄食單胞菌中所有參與控制生物膜形成的HK基因進(jìn)行了系統(tǒng)的突變研究。在62個推定的HK基因中，我們通過同源單交換事件的載體整合方法獲得了51個插入突變體。表型鑒定發(fā)現(xiàn)了一系列參與細(xì)菌生長、游動能力和生物膜發(fā)育的HK基因。其中，一個由雙順反子操縱子編碼的TCS，命名為BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208），被遺傳學(xué)證實(shí)可調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞聚集。BfmK是一個具有自動激酶活性的典型HK，而BfmA作為一個轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合bfmA-bfmK操縱子的啟動子區(qū)域以自動調(diào)節(jié)其自身表達(dá)。此外，BfmA結(jié)合Smlt0800的啟動子區(qū)域以正向調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。該基因編碼一種?；o酶A（acyl-CoA）硫酯酶（命名為AcoT），與生物膜發(fā)育相關(guān)。組氨酸激酶基因的基因組規(guī)模突變分析和BfmA-BfmK系統(tǒng)在生物膜形成中的功能重要性提供了關(guān)于嗜麥芽窄食單胞菌HKs的遺傳信息，以促進(jìn)未來對這種細(xì)菌病原體細(xì)胞調(diào)控的研究。