摘要
在不同環(huán)境條件下（pH 4.5至7，NaCl濃度0.5%至8%，30°C），測定了接種單細(xì)胞李斯特?zé)o害菌（Listeria innocua）的孔洞產(chǎn)生濁度的時間分布。通過統(tǒng)計分析確定，檢測時間T變異性的主要來源是單個細(xì)胞延滯時間（lag time）的變異性。檢測時間與其標(biāo)準(zhǔn)差之間存在線性關(guān)系dev(T)~T。在生長緩慢的條件下，其他變異來源的影響逐漸顯著。
1.引言
濁度測量被用作傳統(tǒng)平板計數(shù)的替代方法，用于估計細(xì)菌的生長參數(shù)（McMeekin等，1993）。隨著預(yù)測微生物學(xué)的新趨勢開始關(guān)注細(xì)菌對食品環(huán)境反應(yīng)的變異性量化，其應(yīng)用日益增加。這在微生物風(fēng)險評估研究中尤為重要。自動化濁度測量系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大量重復(fù)觀測數(shù)據(jù)，這對方差分析計算至關(guān)重要。
濁度是入射光強(qiáng)度與培養(yǎng)物散射光強(qiáng)度之比。在較高細(xì)胞密度（10.0至10.5 CFU/ml）時，它遵循比爾定律，即濁度與細(xì)胞濃度成正比（McMeekin等，1993；Begot等，1996）。比例范圍取決于細(xì)菌的大小和形狀，而這些又受環(huán)境條件的影響。例如，單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）在乳酸存在下具有很窄的線性范圍（Le Marc，2002）。細(xì)胞濃度與濁度之間的相關(guān)性（也稱為校準(zhǔn)）取決于細(xì)菌種類，有時甚至取決于所使用的特定菌株（Begot等，1996）。由于濁度與細(xì)胞濃度之間存在可接受關(guān)系的范圍有限，生長參數(shù)的估計常常不準(zhǔn)確。
一些作者將光密度（OD）曲線的參數(shù)直接與“真實”（活菌計數(shù)）比生長速率和延滯時間聯(lián)系起來（例如Dalgaard等，1994；Begot等，1996；Augustin等，1999；Dalgaard和Koutsoumanis，2001）。他們將生長曲線擬合到OD值，并通過校準(zhǔn)使用這些曲線描述細(xì)胞濃度的增加。在大多數(shù)（但非所有）條件下，結(jié)果相當(dāng)良好（Dalgaard和Koutsoumanis，2001）。作為替代方案，其他作者提出使用觀測到的檢測時間（即細(xì)胞群體達(dá)到可檢測濁度水平所需的時間），而不是整個濁度生長曲線（Cuppers和Smelt，1993；McClure等，1993；Augustin等，1999；Baranyi和Pin，1999；McKellar和Knight，2000）。將檢測時間對初始細(xì)胞濃度作圖，應(yīng)得到一條直線，其斜率與比生長速率成反比。該技術(shù)用于本研究中對單個細(xì)胞延滯時間的群體內(nèi)方差分析。
傳統(tǒng)上，延滯期在“細(xì)胞濃度對數(shù)-時間”曲線上定義。延滯期結(jié)束時間是生長曲線指數(shù)期切線與接種物水平相交的時間點。Baranyi和Roberts（1995）提出了一個更機(jī)械化的定義。引入了初始生理狀態(tài)參數(shù)（a?），延滯期計算為a?及后續(xù)比生長速率的函數(shù)。
單個細(xì)胞的延滯時間與群體延滯期之間的聯(lián)系并不直接。Baranyi（1998,2002）和Baranyi和Pin（2001）分析了這一點，并推導(dǎo)出一個數(shù)學(xué)公式，將個體延滯時間的分布與整個群體的延滯期聯(lián)系起來。該公式意味著，個體延滯時間的平均值可能遠(yuǎn)長于群體水平觀測到的延滯期，盡管個體生理狀態(tài)參數(shù)的平均值與群體的生理狀態(tài)參數(shù)相同。此外，從延滯期到指數(shù)期的過渡曲線可以通過個體延滯時間分布的變換獲得，但就當(dāng)前可用數(shù)據(jù)的精度而言，從群體生長曲線推斷個體延滯時間的分布是不可能的。因此，使用傳統(tǒng)活菌計數(shù)無法研究單個細(xì)胞的延滯時間。自動化濁度測量可能提供解決方案，因為它們適合產(chǎn)生大量重復(fù)檢測時間測量數(shù)據(jù)。如果每個觀測培養(yǎng)物從一個單細(xì)胞開始，那么檢測時間的分布應(yīng)接近初始單個細(xì)胞延滯時間的分布，假設(shè)由單細(xì)胞產(chǎn)生的每個群體的比生長速率相同且恒定。
本文通過單細(xì)胞生成的亞群體產(chǎn)生的濁度檢測時間，確定了李斯特?zé)o害菌的個體延滯時間。細(xì)胞經(jīng)受不同pH和NaCl濃度處理，并通過統(tǒng)計方法分析這些環(huán)境因素對所得分布的影響。
2.材料與方法
2.1.實驗
2.1.1.菌株
使用李斯特?zé)o害菌（L.innocua）作為測試生物，因為它操作安全，且具有與食品病原體單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）相似的特性，后者是食品工業(yè)的主要關(guān)注點。李斯特?zé)o害菌菌株NCTC 11288，血清型6a，保存在3°C存儲的胰蛋白胨大豆瓊脂斜面（TSA,Oxoid）上。
2.1.2.生長曲線
將L.innocua從儲備斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)至胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），并在30°C培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)物用蛋白胨鹽稀釋液（PSDF）按1:1000稀釋，并將50μl接種到50 ml測試培養(yǎng)基中。測試培養(yǎng)基為補(bǔ)充了1%葡萄糖和0.3%酵母提取物（TSYGB,Oxoid）的TSB。用1 M HCl調(diào)節(jié)pH至7.0、5.5、5.0和4.5。在pH 7.0肉湯中添加NaCl，使最終濃度分別為4%、6%和8%NaCl（w/v）。
在接種后立即以及在水浴30°C培養(yǎng)長達(dá)72小時期間間隔取樣。樣品在PSDF中稀釋，并涂布到三個TSA平板上進(jìn)行活菌計數(shù)。
2.1.3.生長實驗
實驗?zāi)康氖谦@得許多單獨體積的培養(yǎng)基，平均接種一至兩個細(xì)胞。
將L.innocua從儲備斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)至TSB，并在30°C培養(yǎng)24小時至穩(wěn)定期。將培養(yǎng)物在PSDF中稀釋至20個細(xì)胞ml^{-1}。將稀釋培養(yǎng)物接種到兩個百孔板的孔中（每孔50mu l）。然后每孔加入350mu l測試培養(yǎng)基（TSYGB pH 7.0，添加或不添加NaCl；或pH 5.5、5.0、4.5，不添加NaCl）。將加滿的板置于Bioscreen C自動讀數(shù)儀（Labsystems）中，在30{}^{circ}C培養(yǎng)。在長達(dá)7天的時間內(nèi)定期在600~nm波長下監(jiān)測濁度。
為了估計接種到每個孔中的細(xì)胞數(shù)量，將接種物培養(yǎng)物的稀釋液涂布到TSA平板上，在30{}^{circ}C培養(yǎng)2天。
每種環(huán)境條件下實驗重復(fù)兩到三次。
2.1.4.檢測時間
檢測時間是孔內(nèi)濁度達(dá)到0.11所需的時間。這對應(yīng)于10^{7}個細(xì)胞ml^{-1}的濃度，并通過每種環(huán)境條件下的活菌計數(shù)進(jìn)行驗證。
2.1.5.讀數(shù)準(zhǔn)確性
通過在與生長實驗相同的條件下進(jìn)行實驗來檢查Bioscreen讀數(shù)的準(zhǔn)確性，但使用10^{7}個細(xì)胞ml^{-1}而不是20個。在最佳條件下，大群體的延滯期應(yīng)是恒定的，因此孔間的變異性即為Bioscreen讀數(shù)的變異性。
2.2.理論
?比生長速率在群體中是同質(zhì)的，并且在初始細(xì)胞第一次分裂后是恒定的；
?每孔初始細(xì)胞數(shù)N_{0}遵循泊松分布。
我們通過實驗驗證：
?檢測水平對應(yīng)于相同的細(xì)胞密度，無論研究條件如何。
?Bioscreen的OD測量不準(zhǔn)確性（噪聲）不顯著。
?在相同生長條件下，檢測時間值是可重復(fù)的。
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