2結果與分析
2.1基因序列分析
將ITS和EF-1α引物進行PCR擴增,菌株SXYTLJ01獲得了長度為500 bp左右的清晰條帶,電泳結果見圖1。將純化的PCR產物測序,分別獲得了511 bp和444 bp的序列。
圖1 PCR擴增產物凝膠電泳結果
將測序所得的基因序列提交到NCBI的GenBank,應用BLAST進行同源序列比對。病原真菌的ITS序列和EF-1α序列與GenBank中Botryosphaeriadothidea分別有99.61%和99.77%的同源性。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取代表葡萄座腔菌屬不同種的ITS序列來構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果顯示:菌株SXYTLJ01與親緣關系較近的葡萄座腔菌(BotryosphaeriadothideaMK448265.1)聚于同一支(圖2)。結合形態(tài)學特征,最終將病原真菌SXYTLJ01鑒定為葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。其ITS和EF-1α測序結果GenBank號分別為Accession No.SUB5881133H-ITS5_A01.ab1MN104148和Accession No.BankIt2240954 H-EF_A01.ab1BotryosphaeriaMN138458。
圖2 SXYTLJ01菌株基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2菌絲結構
菌絲經(jīng)乳酸石炭酚棉蘭染色后的菌絲結構如圖3所示。
圖3葡萄座腔菌菌絲結構圖
注:圖3a為40倍光學顯微鏡下觀察所得；圖3b為100倍下光學顯微鏡下觀察所得。
40倍光學顯微鏡下,可以看到菌絲有明顯節(jié)狀結構,內含橫膈膜,同時菌絲有樹狀分支,有些菌絲聯(lián)結成網(wǎng)狀。100倍光學顯微鏡下,可以看出菌絲內部分隔明顯,將菌絲分隔成多個細胞,且菌絲呈分枝狀態(tài)。
2.3不同脅迫條件下誘導產孢情況分析
由圖4可知:葡萄座腔菌孢子呈卵形或橢圓形,近紫外線照射、菌落劃傷、營養(yǎng)缺乏均能誘導其產孢。近紫外照射下誘導產孢,如圖4a,孢子在菌絲頂端分叉處大量聚集,大小不一。菌落劃傷誘導產孢,如圖4b,孢子呈卵形或橢圓形,有聚集現(xiàn)象。碳氮源缺乏誘導產孢,如圖4c和4d,孢子聚集度小,便于單獨觀察及抑制實驗的進行。
圖4不同脅迫條件下誘導產孢
注:a為紫外誘導產孢圖;b為菌落劃傷誘導產孢圖;c為碳源缺乏誘導產孢圖;d為氮源缺乏誘導產孢圖。
2.4致病菌最適生長條件
2.4.1致病菌生長與溫度的關系培養(yǎng)3 d后,菌落直徑與溫度的關系如圖5所示。
圖5不同培養(yǎng)溫度對菌落生長的影響
由圖5可以看出,溫度是影響該致病菌生長的重要因素,在15～35℃下該菌均能生長,但菌落直徑存在顯著性差異;15～28℃之間,菌落直徑隨著溫度的升高顯著增加,致病菌的最佳生長溫度為28℃;28～35℃之間,菌絲直徑會隨著溫度的升高而持續(xù)下降;高于40℃時,致病菌不再生長。綜上,該致病菌的最適生長溫度為28℃。
2.4.2致病菌生長與光照的關系
培養(yǎng)3 d后,菌落直徑與光照類型之間的關系如圖6所示。
圖6不同光照類型對菌落生長的影響
由圖6可知,無論何種光照類型,菌絲均能生長,但在不同光照條件下菌落直徑存在差異,全光照與全黑暗的菌落直徑差異不顯著,與交替光照的菌落直徑存在顯著性差異。由實驗結果可以看出,在培養(yǎng)到第3 d時,12 h光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)比全光照、全黑暗的菌落直徑大。綜上,光照類型對該菌生長影響明顯,該致病菌的最適生長光照條件為12 h光照/12 h黑暗交替光照。
2.4.3致病菌生長與pH的關系
培養(yǎng)3 d后,菌落直徑與pH的關系如圖7所示。
圖7不同pH對菌落生長的影響
由圖7可以看出,pH在5.0～10.0范圍內該菌均能生長,但在不同pH下菌落直徑存在差異,pH在5.0～7.0范圍內菌落直徑差異不顯著,在8.0～10.0范圍內菌落直徑存在顯著性差異;菌絲生長更適合偏酸性環(huán)境,pH為6.0時菌落直徑最大,說明在pH6.0下菌絲生長速率相對最快;當pH高于6.0時,菌絲還會生長,且隨著pH的升高,菌落直徑差異顯著,但都低于同培養(yǎng)天數(shù)下pH6.0時的菌落直徑。綜上,pH對該致病菌生長影響明顯,偏酸性的環(huán)境更有利于該菌的生長,以pH6.0最佳。
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