1材料與方法
1.1試驗動物及其神經類型分組
本試驗依據現有工作犬神經類型的行為學研究，并根據在實戰(zhàn)中執(zhí)行任務的特征需求制定工作犬神經類型評估標準(表1)。依據此標準，從公安部沈陽警犬基地90頭警用馬里努阿犬中選取14頭典型的安靜型與活潑型犬(體重為25.62kg±2.23kg)，每種類型7頭(公犬4頭，母犬3頭)，所有試驗犬健康、年齡相近(12月齡)。
表1工作犬神經類型評估標準
1.2試驗設計及飼糧
采用配對試驗設計，將14頭馬里努阿犬按照配對要求(性別相同、體重接近)配成7對。試驗飼糧為普瑞納飼料有限公司生產的全價配合飼糧(粗蛋白質含量為27%)，其營養(yǎng)標準滿足NRC(2006)犬營養(yǎng)需要量。試驗周期為30d，其中1~7d為環(huán)境適應期，8~30d為正式試驗期。
1.3飼養(yǎng)管理及樣品采集
所有試驗犬均按照警用工作犬飼養(yǎng)管理規(guī)范進行統(tǒng)一的飼養(yǎng)管理，采用單籠飼養(yǎng)，并在試驗開始前對試驗犬按標準程序進行防疫并驅蟲。每日08:30及16:30分2次飼喂(600g/d)，期間自由飲水。每次進食結束40min后進行自由活動，每次自由活動時間不少于60min。試驗期間定期對試驗場所進行沖洗、消毒。試驗第30天，分別收集試驗犬2次飼喂后首次排出的新鮮糞便10g，每頭試驗犬的兩個糞便樣品混合均勻后置于EP管中，于-80℃待測。
1.4指標測定與方法
采用QiagenDNA提取試劑盒提取試驗犬糞便總DNA，提取步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。對提取的總DNA進行純化、檢測濃度和純度。以提取的糞便總DNA為模板，對細菌V3~V4區(qū)進行PCR擴增，所用上游引物為341F(5'-CCTACGGG?NGGCWGCAG-3')，下游引物為805R(5'-GACT?ACHVGGGTATCTAATCC-3')。PCR擴增體系20μL:5×FastPfuBuffer4μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，5μmol/L上、下游引物各1.0μL，FastPfuPolymerase0.4μL，DNA模板10ng，補ddH2O至20μL。PCR反應條件:95℃預變性3min;95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共27個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、切膠回收后，進行高通量測序。對測得的序列，使用USEARCH(11.0.667)在相似閾值大于97%的情況下將符合條件的序列分配到相同操作分類單元(OTU);基于QIIME2軟件，使用SILVA數據庫(138.1)對OTU進行分類物種注釋;使用Mothur(1.45.3)對各樣本物種進行Alpha多樣性分析;采用主坐標分析方法(PCoA)對各樣本物種復雜性進行Beta多樣性分析;使用R(4.4.0)中microeco包(1.8.0)進行LEfSe分析，設置LDA閾值為2.5(lg);使用R(4.4.0)中psych包(2.4.6)進行相關性分析。
1.5數據統(tǒng)計分析
試驗數據采用SAS9.4的MEANS模塊對基本統(tǒng)計量進行分析，采用Paired-SampleT Test對不同處理犬的糞便微生物指標和血液生化指標進行差異性分析;基于SPARCC方法統(tǒng)計14頭犬糞便菌群之間的相關性(分別在門水平和屬水平上統(tǒng)計)，P小于0.05為差異顯著;P小于0.01為差異極顯著。
使用GraphPadPrism8.0軟件作圖。
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