1.5堿性磷酸酶(AKP)活性測(cè)定
測(cè)定不同濃度沒食子酸溶液在不同時(shí)間對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞壁的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的溶藻弧菌5 000 r/min離心5 min，用PBS重懸配制成1×10?CFU/mL的菌懸液。實(shí)驗(yàn)組為在10 mL 1×10?CFU/mL溶藻弧菌菌液中分別加入10 mL不同濃度的沒食子酸溶液，使藥物終濃度分別為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS為陽性對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)平行。溶藻弧菌在28℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8 h時(shí)各組的每個(gè)平行取樣1 mL，在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液備用，使用AKP試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)測(cè)定上清液在520 nm波長(zhǎng)下的吸光值，并按說明書計(jì)算各組AKP活性。
1.6電導(dǎo)率測(cè)定
測(cè)定不同濃度沒食子酸在2 h時(shí)對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞膜的影響。各組處理方法參照1.5。溶藻弧菌在28℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 h，各組分別取樣9 mL，在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌體培養(yǎng)液的電導(dǎo)率。
1.7生物被膜的形成
采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定不同濃度沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成的影響。菌液配制方法參照1.3。分別取100μL不同濃度的沒食子酸溶液加入到96孔板中，并加入等量的1×10?CFU/mL菌液，使沒食子酸溶液的終濃度分別為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS為陽性對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)平行。溶藻弧菌在28℃靜置培養(yǎng)24 h后，將孔中液體吸出，并用無菌PBS沖洗去除浮游細(xì)菌，添加200μL甲醇固定15 min，加入200μL 0.5%的結(jié)晶紫溶液，室溫靜置20 min，吸出結(jié)晶紫溶液，無菌蒸餾水沖洗并風(fēng)干。加入200μL 33%的醋酸溶液溶解，靜置15 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm條件下的吸光值，以33%醋酸溶液為空白對(duì)照。
1.8生物被膜的清除
采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定不同濃度沒食子酸溶液對(duì)成熟生物被膜清除的影響。菌液配制方法如1.3。在96孔板各孔中分別加入200μL 1×10?CFU/mL菌液。28℃靜置培養(yǎng)24 h后，將孔中液體吸出，并用無菌PBS輕柔沖洗2次，晾干后得到成熟生物被膜。在形成生物被膜的各孔中，分別各添加200μL 2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC的沒食子酸溶液作為實(shí)驗(yàn)組，添加200μL PBS作為對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)平行。28℃靜置培養(yǎng)24 h后將孔中液體吸出，并用無菌PBS沖洗2次，200μL甲醇固定15 min，加入200μL 0.5%的結(jié)晶紫溶液，室溫靜置20 min，吸出結(jié)晶紫溶液，無菌蒸餾水沖洗并風(fēng)干。用200μL 33%醋酸溶液溶解，15 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處的吸光值，以33%醋酸溶液為空白對(duì)照。
1.9泳動(dòng)能力測(cè)定
測(cè)定不同濃度沒食子酸對(duì)溶藻弧菌泳動(dòng)能力的影響。按1.3中的方法配制菌液。配制含濃度為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC沒食子酸的0.3%瓊脂LB半固體平板。含等量PBS的0.3%瓊脂LB半固體平板作為對(duì)照組。取2μL 1×10?CFU/mL的菌液接種于平板中心，28℃靜置培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法測(cè)定細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑大小。
1.10聚集能力測(cè)定
測(cè)定不同濃度沒食子酸對(duì)溶藻弧菌的聚集能力的影響。按1.3中的方法配制菌液。實(shí)驗(yàn)組為取10 mL 1×10?CFU/mL溶藻弧菌菌液，分別加入等量不同濃度的沒食子酸溶液，使藥物終濃度為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。陽性對(duì)照組為在菌液中加入等量PBS。每組設(shè)3個(gè)平行。28℃培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)結(jié)束，在靜止?fàn)顟B(tài)下，各管分別吸取3 mL菌液測(cè)定其在600 nm處的吸光度，再將各管剩余菌液振蕩懸浮，測(cè)定其在600 nm處的吸光度。計(jì)算公式為：
2結(jié)果
2.1沒食子酸對(duì)溶藻弧菌的抑菌作用
采用二倍稀釋法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定沒食子酸對(duì)溶藻弧菌的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沒食子酸對(duì)溶藻弧菌的MIC和MBC分別為4 mg/mL和8 mg/mL。
不同濃度的沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)的影響效果見圖1。2MIC和1MIC的沒食子酸能完全抑制溶藻弧菌生長(zhǎng)，OD值顯著低于不加藥物的陽性對(duì)照組。1/2MIC的沒食子酸能顯著抑制溶藻弧菌生長(zhǎng)，菌株在8 h左右達(dá)到平臺(tái)期，平臺(tái)期菌液濃度明顯低于陽性對(duì)照組。1/4MIC的沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)無明顯影響。綜上所示，1/2MIC以上濃度的沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)有良好的抑制作用，且抑制效果隨濃度增加逐漸增強(qiáng)。
2.2沒食子酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞壁完整性的影響
細(xì)胞壁是細(xì)菌維持形態(tài)、保護(hù)菌體的重要結(jié)構(gòu)。AKP位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，在細(xì)胞壁未受損時(shí)，胞外無法檢測(cè)到AKP，當(dāng)細(xì)胞壁被破壞受損時(shí)，AKP從細(xì)胞中漏出，AKP可以作為評(píng)價(jià)細(xì)胞壁通透性的指標(biāo)。不同濃度沒食子酸對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞壁的影響見圖2。結(jié)果顯示，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC處理組的細(xì)菌培養(yǎng)液中AKP含量前2 h迅速上升，之后呈逐漸穩(wěn)定上升的趨勢(shì)。結(jié)果表明，1、2、4、8 mg/mL濃度的沒食子酸在2 h內(nèi)均能破壞溶藻弧菌細(xì)胞壁或增加細(xì)胞壁的通透性，導(dǎo)致AKP滲出。沒食子酸溶液濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)溶藻弧菌細(xì)胞壁的破壞程度越大。與處理組相比，陽性對(duì)照組的AKP含量始終處于較低水平，且無明顯變化。其在4~8 h的含量上升，推測(cè)可能是細(xì)菌正常生命活動(dòng)過程中的裂解死亡所致。
2.3沒食子酸對(duì)溶藻弧菌電導(dǎo)率的影響
細(xì)胞膜是細(xì)菌強(qiáng)有力的保護(hù)屏障，而細(xì)胞膜的導(dǎo)電性是細(xì)胞膜通透性的重要指標(biāo)，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性被破壞，滲透性增加，細(xì)胞中的Na?、K?泄漏，導(dǎo)致上清液的電導(dǎo)率變大。不同濃度的沒食子酸對(duì)溶藻弧菌電導(dǎo)率影響結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，1/2MIC、1MIC和2MIC處理組的細(xì)菌培養(yǎng)液在2 h時(shí)，OD450mm顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；1/4MIC處理組的細(xì)菌培養(yǎng)液在2 h時(shí)，OD450mm與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。1/2MIC以上濃度的沒食子酸可顯著增強(qiáng)溶藻弧菌細(xì)胞膜的通透性，且其作用強(qiáng)度隨沒食子酸濃度增加而增強(qiáng)。
注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
2.4沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成的影響
生物膜是細(xì)菌重要的生存策略，具有抵抗外界環(huán)境壓力、提供營(yíng)養(yǎng)支持、促進(jìn)表面粘附和傳導(dǎo)信號(hào)等作用。不同濃度沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成的影響如圖4所示。與陽性對(duì)照組相比，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC濃度沒食子酸對(duì)溶藻弧菌生物被膜的形成均有顯著抑制作用(P<0.05)，抑制率分別為16.61%、32.37%、77.80%和83.26%。結(jié)果表明，沒食子酸能有效抑制溶藻弧菌生物被膜的形成，抑制作用隨其濃度的增加而增強(qiáng)。
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