本研究揭示了插入序列（IS）在原核生物基因組中的轉(zhuǎn)座如何導致CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的失活。CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物用來防御外來遺傳元素的主要機制，通過特定的導向RNA（crRNA）指導Cas蛋白識別并切割目標序列。研究者通過篩選原核生物基因組序列，發(fā)現(xiàn)了多個自然發(fā)生的IS插入事件，這些事件破壞了CRISPR-Cas位點，尤其是IS1和IS10，它們顯示出對靶標特異性的顯著放寬。本研究構建了一個IS捕獲系統(tǒng)，監(jiān)測在雙鏈DNA斷裂誘導后IS插入到cas基因的事件，發(fā)現(xiàn)IS轉(zhuǎn)座在DNA修復機制存在的情況下仍然可以發(fā)生，并且IS轉(zhuǎn)座也檢測到其他宿主防御系統(tǒng)的插入。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了IS在抵消CRISPR-Cas活性、增加細菌對外國DNA入侵的易感性方面的潛力，這可能有助于細菌獲取有益的外源性移動遺傳元素（MGEs），增強環(huán)境適應性。研究還探討了IS在細菌適應性中的角色，包括它們?nèi)绾瓮ㄟ^破壞CRISPR-Cas系統(tǒng)來促進有益MGEs的獲取，以及這種機制如何影響細菌的進化。通過異源表達特定類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，并構建含有特定原間隔序列的質(zhì)粒，研究驗證了IS插入對CRISPR-Cas系統(tǒng)的干擾作用。這項研究不僅增進了對CRISPR-Cas系統(tǒng)和IS之間相互作用的理解，還對抗生素抗性傳播和細菌進化的研究具有重要意義。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應用
Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于測定不同TIR防御系統(tǒng)在大腸桿菌中表達時對噬菌體感染的反應。通過將單個轉(zhuǎn)化體在37°C下用適當?shù)目股卦贚B培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后以1：100稀釋并接種到含有400μL LB肉湯和不同抗生素濃度的Bioscreen 100孔蜂窩板中。在37°C下每20分鐘監(jiān)測一次OD 600，持續(xù)25小時，并在Bioscreen C設備（Bioscreen C Labsystems）中連續(xù)搖動。通過測量細菌的吸光度（OD600），了解噬菌體感染對細菌生長的影響，以及TIR系統(tǒng)是否有效抑制了噬菌體的增殖。Bioscreen被用于快速篩選和鑒定那些能夠逃避TIR防御系統(tǒng)的噬菌體。通過連續(xù)監(jiān)測細菌培養(yǎng)的生長情況，研究人員可以識別出在TIR防御系統(tǒng)存在下仍能生長的噬菌體，這些噬菌體可能是通過突變獲得了逃避TIR系統(tǒng)的能力。
實驗結果
本研究強調(diào)了插入序列（IS）在細菌適應性進化中的關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，IS元件能夠通過破壞CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，增加細菌對外國DNA的易感性，從而促進有益外源基因的獲取。這種機制揭示了細菌在遺傳防御和外源基因獲取之間的進化權衡關系。具體來說，IS元件，尤其是IS1和IS10，通過轉(zhuǎn)座至cas基因，顯著放寬了靶標特異性，導致CRISPR-Cas系統(tǒng)的失活。即便在DNA修復機制存在的情況下，IS轉(zhuǎn)座至cas基因的活動仍然持續(xù)，并且這種轉(zhuǎn)座活動也影響到了其他宿主防御系統(tǒng)。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓寬了我們對CRISPR-Cas失活機制的理解，而且對于深入理解細菌遺傳多樣性、定殖、生存和進化策略提供了新的視角。
圖1、IS元件向CRISPR-Cas基因座的天然轉(zhuǎn)座。顯示了在CRISPR-Cas基因座中發(fā)現(xiàn)的每個IS元件的代表性示例。箭頭代表CRISPR-Cas簇內(nèi)的IS（用星號標記）和基因，箭頭方向表示IS插入或基因轉(zhuǎn)錄的方向。物種名稱下方的基因組坐標表示每個cas簇的范圍，編號線表示每個基因或IS在相應區(qū)域內(nèi)的相對位置。
圖2、IS失活的CRISPR-Cas系統(tǒng)有助于快速獲取和提高含有可識別原始間隔區(qū)的抗生素抗性質(zhì)粒的持久性。a）E.amylovora 7-3的工程型I-E CRISPR-Cas基因座示意圖。將完整或IS10中止的CRISPR-Cas基因座分別克隆到質(zhì)粒pEraCas或pEraCas-IS10中，用于CRISPR-Cas干擾測定。b）E.amylovora 7-3型I-E CRISPR-CAS系統(tǒng)對大腸桿菌DH10B細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化干擾。通過計算每100 ng質(zhì)粒的集落形成單位（CFU）來確定轉(zhuǎn)化效率。數(shù)據(jù)顯示為來自三個生物學重復的±SD平均值;**P<0.01;ns不顯著，使用log10轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)的雙尾未配對t檢驗;P=0.0018,0.6150（從左到右）。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供。c）不同抗生素暴露下供試菌株的生長曲線。陰影區(qū)域表示3次生物學重復±S.D.的平均值。氨芐青霉素（Amp）用于維持宿主體內(nèi)的pEraCas或pEraCas-IS10，氯霉素（Chl）和壯觀霉素（Spe）用于維持p15A-Eraprotos-spe和p15A-spe。
圖3、IS介導了在選擇壓力下獲得質(zhì)粒的好處和遺傳denfense之間的適應性權衡。a)在SYHY01和SYHY02中轉(zhuǎn)化和傳代期間的質(zhì)粒穩(wěn)定性。b)大腸桿菌DH10B中pEraCas和pEraCas-pBAD的cas操縱子內(nèi)8個基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。通過RT-qPCR定量基因表達并歸一化為內(nèi)源性16sRNA水平。c）通過計數(shù)每200 ng質(zhì)粒的CFU來確定pEraCas（靶向SYHY03染色體）、pEraCas-IS10（對照）和pEraCas-pBAD（在l-阿拉伯糖存在下靶向SYHY03染色體）向SYHY03的轉(zhuǎn)化效率。d）pEraCas-pBAD攜帶L-阿拉伯糖誘導型pBAD啟動子以驅(qū)動cas操縱子表達的示意圖。引物對P1和P2旨在擴增pEraCas-pBAD的整個cas操縱子;顯示了預期的擴增子大小。e使用引物對P1和P2對IS插入pEraCas-pBAD cas操縱子進行菌落PCR篩選。泳道“WT”，用pEraCas-pBAD模板對照擴增子;較大的PCR產(chǎn)物（泳道C5、D1和D6）提示IS轉(zhuǎn)座事件。f）通過Sanger測序確認IS插入突變體C5、D1和D6的cas操縱子中。
圖4、僅誘導Cas蛋白表達不會導致宿主菌株出現(xiàn)明顯的生長缺陷。在IPTG誘導和非誘導條件下，編碼不同Cas蛋白變體的菌株的生長曲線。
圖5、在NHEJ存在下IS轉(zhuǎn)座到cas基因中。a)示意圖顯示了三個NHEJ系統(tǒng)的組裝，其中包括參與NHEJ修復的ku和ligD基因。b)在含有ompF（由SpCas9-HF1/sgRNA介導的DSB靶基因）的MG1655-ΔrecA中測定轉(zhuǎn)座頻率，然后進行易錯的NHEJ DNA修復。添加l-阿拉伯糖（10 mM）誘導ku表達。每個板最多隨機選擇45個存活菌落進行PCR驗證，并計算每種條件下IS插入SpCas9-HF1編碼區(qū)的比例。
總結
CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)通過抑制移動遺傳元件的入侵來保護原核基因組。研究人員篩選了原核基因組序列，并鑒定了插入序列（IS）到cas基因中的多個自然轉(zhuǎn)座，從而滅活CRISPR-Cas防御。使用具有各種IS和誘導型cas核酸酶的大腸桿菌菌株生成了一個IS捕獲系統(tǒng)，以監(jiān)測作為生理宿主應激誘導雙鏈DNA斷裂后IS插入cas基因的情況。研究人員鑒定了由不同ISs介導的多個事件，尤其是IS1和IS10，顯示出顯著的松弛靶標特異性。在DNA修復機制存在的情況下，IS轉(zhuǎn)座到cas中得以維持，并且還檢測到轉(zhuǎn)座到其他宿主防御系統(tǒng)。Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于測定不同TIR防御系統(tǒng)在大腸桿菌中表達時對噬菌體感染的反應。通過連續(xù)監(jiān)測細菌培養(yǎng)的生長情況，研究人員可以識別出在TIR防御系統(tǒng)存在下仍能生長的噬菌體，這些噬菌體可能是通過突變獲得了逃避TIR系統(tǒng)的能力。Bioscreen的使用使得研究人員能夠自動化地完成這些測量和分析，大大提高了實驗的效率和準確性。本研究結果強調(diào)了IS對抗CRISPR活性的潛力，從而增加細菌對外源DNA侵襲的易感性。研究還探討了IS在細菌適應性中的角色，包括它們?nèi)绾瓮ㄟ^破壞CRISPR-Cas系統(tǒng)來促進有益MGEs的獲取，以及這種機制如何影響細菌的進化。通過異源表達特定類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，并構建含有特定原間隔序列的質(zhì)粒，研究驗證了IS插入對CRISPR-Cas系統(tǒng)的干擾作用。這項研究不僅增進了我們對CRISPR-Cas系統(tǒng)和IS之間相互作用的理解，還對抗生素抗性傳播和細菌進化的研究具有重要意義。
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