2.5.最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）
采用MTT法測定細菌細胞的增殖。簡言之，將細菌細胞（10^6 CFU/mL）以200μL/孔接種到96孔微孔板中的Mueller-Hinton肉湯中。將貫葉連翹提取物的兩倍系列稀釋液加入到含有細菌細胞的孔中。在37°C培養(yǎng)24小時后，每個濃度進行三次重復(fù)測定（n=3）。24小時后，向每孔加入10μL MTT（5 mg/mL）試劑，并將板在37°C下孵育4小時。然后，加入DMSO（100μL）終止反應(yīng)，輕輕搖晃板以重新溶解形成的晶體。使用Synergy 4微孔板讀數(shù)儀（BioTek Instruments,Winooski,VT,USA）測量每孔的吸光度。所有結(jié)果表示為細胞增殖抑制率，計算公式為[（A-B）/A]x 100%，其中A和B分別為對照組和樣品組的平均活菌數(shù)。MIC是抑制任何可見生長的測試樣品的最低濃度。
MBC定義為殺死99.9%細菌接種物的最低濃度，通過將來自微孔板各孔的20μL培養(yǎng)物重新接種到Mueller-Hinton瓊脂平板上確定。在37°C培養(yǎng)18小時后，通過肉眼觀察瓊脂平板上的細菌生長情況確定MBC。所有MIC和MBC測量至少重復(fù)進行兩次。
2.6.時間-效應(yīng)關(guān)系測定
在含有補充了5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL貫葉連翹提取物的新鮮制備的Mueller-Hinton肉湯的孔中，接種10^6 CFU/mL的藤黃微球菌，并在37°C培養(yǎng)。每小時通過自動測量600 nm處的吸光度（Bioscreen C,Labsystems,Helsinki,Finland）測定藤黃微球菌細胞的吸光度。
2.7.貫葉連翹提取物對藤黃微球菌細胞蛋白質(zhì)的影響
用貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）培養(yǎng)8小時后，收集藤黃微球菌細胞（10^6 CFU/mL），并使用超聲波方法提取總蛋白。然后，將樣品與等體積的上樣緩沖液混合，并通過12%SDS-PAGE進行分離。電泳后，用考馬斯亮藍（CBB）染色蛋白質(zhì)，以檢查藤黃微球菌細胞中的蛋白質(zhì)組成。使用odyssey（Li-Cor,USA）對凝膠進行拍照。
2.8.流式細胞術(shù)
用貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）處理藤黃微球菌細胞。8小時后，收獲藤黃微球菌細胞，并根據(jù)制造商的建議（天津華大基因生物技術(shù)有限公司，中國），在室溫下避光用異硫氰酸熒光素（FITC）-Annexin V和碘化丙啶（PI）染色15分鐘。使用配備CellQuest軟件（BD Biosciences）的流式細胞儀（FACScan;BD Biosciences）分析細胞。將細胞分為活細胞、壞死細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。計算早期和晚期凋亡細胞的相對比例以進行進一步比較。該實驗重復(fù)超過三次。
2.9.TUNEL測定
使用凋亡原位檢測試劑盒（Promega,Germany），通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法，對凋亡細胞中DNA片段的3'-OH進行標記和染色，按照制造商的說明進行。使用熒光顯微鏡（Olympus,FV1000,Japan）捕獲熒光素標記的TUNEL陽性細胞的圖像。此外，TUNEL測定作為流式細胞術(shù)的補充方法進行，以比單獨流式細胞術(shù)更準確地證明凋亡水平。細胞核用DAPI（Invitrogen,Molecular Probes,Eugene,OR）標記為藍色，缺口末端標記為綠色。細胞核（藍色）和缺口末端（綠色）標記之間的合并顯示為紫色。
2.10.DNA Laddering測定
將藤黃微球菌細胞（10^5 CFU/mL）與貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）一起培養(yǎng)8小時。然后使用凋亡Ladder檢測試劑盒（Beyotime,China）提取藤黃微球菌細胞的基因組DNA。然后將DNA在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并通過溴化乙錠（EB）染色顯影。在紫外光下對凝膠進行拍照。
2.11.貫葉連翹提取物對膜電位的影響
將藤黃微球菌細胞與貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）在37°C下培養(yǎng)。八小時后，收集細胞，用冷PBS洗滌兩次，用Rhodamine 123（Sigma,Germany）在37°C下染色30分鐘，然后通過FACScanto（BD Biosciences）進行分析。
2.12.統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤（SE），所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）進行。此外，p<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
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