2.2土壤細(xì)菌群落的多樣性分析
Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)是反映微生物群落豐富度和多樣性的重要指標(biāo)。6塊試驗(yàn)田不同月土壤細(xì)菌的Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)見圖5，CK與EG不同月的Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)見表1。根據(jù)圖5中Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)隨時(shí)間的變化規(guī)律表明：4月CK和EG物種多樣性與豐度高于其他4個(gè)月，在5月EG物種多樣性與豐度最低。由表1可知，CK與EG的Chao1、Faith_pd、Observed和Shannon指數(shù)在4?8月份存在一定差異，6月CK與EG對(duì)應(yīng)的4個(gè)α多樣性指數(shù)差異不大，5月CK與EG對(duì)應(yīng)的4個(gè)多樣性指數(shù)差異最大，且EG的α多樣性指數(shù)遠(yuǎn)小于CK，從而導(dǎo)致5月CK的物種多樣性指數(shù)遠(yuǎn)高于EG。通過CK與EG在4?8月物種多樣性指數(shù)變化表明稻田環(huán)溝引入蟹后可以明顯改變土壤中細(xì)菌群落的物種多樣性與豐度，其中4月和8月可以提高細(xì)菌群落的物種多樣性與豐度，5月降低細(xì)菌群落的物種多樣性，而6月對(duì)細(xì)菌群落的物種多樣性與豐度的影響不明顯。
2.3細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成
2.3.1門水平分類下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成
在門水平下，將試驗(yàn)田CK和EG在4?8月相對(duì)豐度排名前20的土壤細(xì)菌繪制柱形圖(圖6A)。細(xì)菌群落主要由變形菌門(Proteobacteria,96.64%?23.19%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,19.85%?0.35%)、脫硫桿菌門(Desulfobacterota,17.48%?0.01%)、放線菌門(Actinomycetota,10.99%?0.79%)、綠屈撓菌門(Chloroflexi,10.84%?0.21%)、厚壁菌門(Firmicutes,8.75%?0.65%)、出芽單胞菌門(Gemmatimonadota,7.17%?0.81%)、酸桿菌門(Acidobacteria,5.02%?0.32%)、藍(lán)菌門(Cyanobacteria,4.35%?0.01%)和疣微菌門(Verrucomicrobiota,3.49%?0.02%)、等構(gòu)成。其中最優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，較優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門和脫硫桿菌門。
圖3不同月份CK和EG組土壤6種理化指標(biāo)的變化特征
圖4土壤理化因子相關(guān)性分析
圖5不同月份試驗(yàn)田土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)
表1不同月份試驗(yàn)田土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)
圖6不同月份土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度
CK與EG的優(yōu)勢(shì)菌門具有顯著的差異。CK在4?8月優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、擬桿菌門、脫硫桿菌門和綠彎菌門，其中變形菌門相對(duì)豐度處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但在4?8月變形菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。EG在4?8月變形菌門相對(duì)豐度處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在5月其相對(duì)豐度最高(96.64%)，綠彎菌門在4?8月其相對(duì)豐度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(除5月外)。與CK相比，引入蟹后的EG在4?8月相對(duì)豐度排名前20的細(xì)菌累積相對(duì)豐度都高于CK，說(shuō)明引入蟹后能明顯改變稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和物種豐度。
對(duì)相對(duì)豐度前10的細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)性分析，研究表明變形菌門與其菌門呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，與擬桿菌門、脫硫桿菌門和厚壁菌門的相關(guān)系數(shù)分別為?0.608、?0.541和?0.602，且呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。除變形菌門外，擬桿菌門與其他菌門呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，與疣微菌門、藍(lán)細(xì)菌門和酸桿菌門的相關(guān)系數(shù)分別為0.385、0.422和0.417，都呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。
2.3.2屬水平分類下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成
在屬水平下，將試驗(yàn)田EG與CK在4?8月相對(duì)豐度排名前10的土壤細(xì)菌繪制柱形圖(圖6B)。試驗(yàn)田土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度前10的細(xì)菌屬分別為Pseudomonas(84.11%?2.69%)、Thiobacillus(33.18%?0.31%)、Methanosaeta(20.12%?0.14%)、Unspecified_Bacteria(17.18%?1.55%)、Unspecified_Prolixibacteraceae(9.87%?0.02%)、Unspecified_Anaerolineaceae(9.06%?0.07%)、WCHB1_32(7.02%?0.07%)、Hydrogenophaga(5.21%?0.25%)、Sphingomonadaceae(5.19%?0.05%)、Unspecified_ Burkholderiales(5.06%?0.05%)和Unspecified_ Comamonadaceae(3.28%?0.01%)。CK與EG土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性也有各自特征。4?8月EG中Pseudomonas相對(duì)豐度始終高于CK，且EG中Pseudomonas相對(duì)豐度一直處于較高水平，特別在5?7月。CK中相對(duì)豐度較高的菌屬為Thiobacillus、Unspecified_Bacteria、Methanosaeta和WCHB1_32菌屬。在4?8月EG中Thiobacillus的相對(duì)豐度都低于CK。通過CK與EG屬水平排名前10的菌屬相對(duì)豐度對(duì)比表明，引入蟹后會(huì)提高EG土壤細(xì)菌中Pseudomonas菌屬的相對(duì)豐度，同時(shí)也會(huì)降低Thiobacillus和Methanosaeta菌屬的相對(duì)豐度。
2.4細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較
利用基于Bray-Curtis距離的NMDS方法評(píng)估不同種養(yǎng)模式及不同月土壤細(xì)菌群落的相似性，結(jié)果見圖7。Stress<0.2表明圖形具有較好的表現(xiàn)意義，R>0表示分組有效，P<0.05為顯著性差異，橢圓是質(zhì)心周圍的95%置信區(qū)間。由圖8可知，ANOSIM統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯示，CK與EG土壤細(xì)菌群落的組成存在顯著差異(Stress=0.080<0.2,P-value=0.001,R=0.706)，同時(shí)CK和EG土壤細(xì)菌群落與不同采樣月有顯著差異(Stress=0.080<0.2,P-value=0.014,R=0.176。結(jié)果表明引入蟹后對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響遠(yuǎn)大于采樣月的影響。
2.5不同種養(yǎng)模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與理化因子的相關(guān)性
采用冗余分析(RDA)對(duì)試驗(yàn)田土壤理化因子和土壤細(xì)菌門水平主要物種進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過計(jì)算方差膨脹因子系數(shù)VIF值，表明7個(gè)理化因子膨脹系數(shù)均小于5。在門水平上將理化因子與土壤排名前10的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落進(jìn)行RDA分析(圖8A)。環(huán)境因子的長(zhǎng)度表征對(duì)土壤細(xì)菌的影響，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，相關(guān)性越高，影響越大；當(dāng)環(huán)境因子與菌門的夾角為余弦值時(shí)，余弦絕對(duì)值越大，則影響程度越高，值為正表示正相關(guān)，為負(fù)表示負(fù)相關(guān)；若正交，則不相關(guān)。蒙特卡洛檢驗(yàn)結(jié)果表明，TN是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子。
圖7土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同區(qū)域和不同月份的非度量多維尺度分析(NMDS)與ANOSIM分析
圖8理化因子與土壤微生物群落組成(門水平)相關(guān)分析A：RDA分析.B：相關(guān)性熱圖.
對(duì)土壤細(xì)菌群落中相對(duì)豐度排前10的優(yōu)勢(shì)菌門與土壤理化因子進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析(圖8B)，結(jié)果表明所選7個(gè)理化因子中TDS、TN、TP、AP和SOM與相對(duì)豐度前10的菌門具有顯著性差異，其中AP與放線菌門和綠屈撓菌門呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.001)，相關(guān)系數(shù)分別為?0.636和?0.746。TN主要影響變形菌門、擬桿菌門、脫硫桿菌門和疣微菌門，且與它們都呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。pH和TK與相對(duì)豐度前10的優(yōu)勢(shì)菌門均無(wú)顯著性差異，與細(xì)菌主要呈正相關(guān)關(guān)系，且與優(yōu)勢(shì)菌門的相關(guān)性系數(shù)r<0.4。
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