我國肉與肉制品產(chǎn)量巨大，2021年人均肉類消費量達到了23.9 kg，產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢頭迅猛。肉品具有較高的水分活度和適宜的pH，極易被微生物污染引起腐敗變質(zhì)。在肉品加工、儲存和零售過程中，微生物是導致肉品腐敗的主要原因，每年給肉類行業(yè)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟損失。因此，防止或延緩肉品腐敗是全球食品行業(yè)共同關注的問題，也是近年來食品科學領域的研究熱點。
芽孢桿菌作為食品中常見的優(yōu)勢腐敗菌，廣泛地存在于在各類食品中。國內(nèi)外關于芽孢桿菌的研究較多，對芽孢桿菌的形態(tài)、分類等已有較為透徹的研究，研究證明芽孢桿菌是肉制品中的優(yōu)勢腐敗菌之一。對獅子頭中腐敗菌進行菌群結(jié)構分析，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在三個處理組中所占的豐度值為20%左右，是獅子頭腐敗過程中的主要優(yōu)勢菌。甯雨蕎等在分離市售筍子燒牛肉中的腐敗菌時發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的致腐能力最強。同時，芽孢桿菌還具有較強的抗逆性，傳統(tǒng)的巴氏殺菌很難將其殺滅，在后續(xù)合適的環(huán)境條件下會迅速繁殖，造成食品腐敗變質(zhì)。WEBB等綜述了蠟樣芽孢桿菌在低溫食品中的危害，楊嘯吟等進一步論述了不同包裝的冷卻肉腐敗過程中揮發(fā)性氣體與芽孢桿菌等腐敗菌之間的關聯(lián)，再次表明芽孢桿菌是導致肉類腐敗的主要細菌。目前針對芽孢桿菌的研究已證明其為低溫肉制品中腐敗能力較強的腐敗菌，但缺乏對于肉源性芽孢桿菌不同菌株之間腐敗性能異質(zhì)性的研究。本研究認為，分析不同芽孢桿菌之間腐敗性能的差異，是研發(fā)針對性防控芽孢桿菌污染技術的基礎。
在微生物污染之后，肉品常見的腐敗特征包括產(chǎn)酸、產(chǎn)氣和發(fā)粘等，這是由微生物多種內(nèi)源酶的氧化分解作用引起的。為了探究不同芽孢桿菌在肉品腐敗中的主要致腐特性，根據(jù)肉品腐敗特征，本研究擬探索6株肉源性芽孢桿菌的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、腐敗酶等特性，為后續(xù)進行肉制品中芽孢桿菌針對性防控提供理論基礎。
1.材料與方法
1.1材料與儀器
試驗所用的6株芽孢桿菌均由南京農(nóng)業(yè)大學國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術研究中心提供，分離自低溫香腸，具體見表1；LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、玉米油（脂酶）細菌微量生化鑒定管、可溶性淀粉瓊脂、盧戈氏碘液等均購于青島海博生物技術有限公司；干酪素購于北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均購于國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、95%乙醇均購于上海麥克林生化科技有限公司。
表1 6株芽孢桿菌信息
BIOⅡAdcance4 Sterile GARD生物安全柜西班牙Telstar公司；Scan1200自動影像分析菌落計數(shù)儀法國Interscience公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海森信實驗儀器有限公司；SQL1010C立式壓力蒸汽滅菌器日本Yamato公司；渦旋振蕩器美國Scilogex公司；Testo 205便攜式pH計德國Testo公司；M2e酶標儀美國MD公司；PD500勻漿機英國PRIMASCI公司；MUL-9000系列超純水系統(tǒng)美國Milli-Q公司。
1.2實驗方法
1.2.1菌株活化
將6株在?80℃冷凍保存的芽孢桿菌于室溫下進行解凍，用接種環(huán)沾取菌液在LB營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，在36±1℃培養(yǎng)24 h后將單菌落挑入LB肉湯中，于36±1℃培養(yǎng)24 h，完成第一次液體擴培；取200μL擴培菌液移入至新的LB肉湯，于36±1℃培養(yǎng)24 h，完成第二次活化，備用。
1.2.2基本特性
1.2.2.1生長曲線測定
取0.2 mL活化菌液接種至5 mL的LB肉湯中，分別放在20℃和37℃溫度條件下培養(yǎng)24 h，每3 h取樣測定600 nm下的吸光度。
1.2.2.2產(chǎn)酸能力測定
取0.5 mL活化后的菌液接種至5 mL的LB肉湯中，放置于20℃和37℃下培養(yǎng)，在第0、6、12、24、36、48 h取樣，8000×g離心5 min，取上清測量pH，結(jié)果以不添加菌株的LB肉湯的空白組上清pH數(shù)值減去測試菌株的上清pH數(shù)值表示。
1.2.2.3產(chǎn)氣能力測定
在玻璃試管中注入5 mL的LB肉湯并放入Durham管，接種菌液前保證Durham管內(nèi)無氣泡，取0.8 mL活化后的菌液接種至滅菌后的玻璃試管中，用橡膠塞密封；將所有的玻璃試管置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)，在第12、24、36、48和72 h測量Durham管中的氣柱高度。
1.2.3腐敗酶
1.2.3.1蛋白酶活力測定
液體法測蛋白酶參照國標《GB/T 23527-2009蛋白酶制劑》中提供的福林法并稍作改良。
活化后的菌液用8500×g離心5 min，上清即為粗酶液。樣品組每管加入0.1 mL酪蛋白溶液，空白組每管加入0.2 mL三氯乙酸溶液，于40±0.2℃的溫度下孵育10 min后用福林溶液顯色，待顯色完全，在680 nm測定吸光度。制作蛋白酶液體法標準曲線，得出濃度與吸光度之間的擬合公式為Y=0.0053X?0.0024，擬合度R2>0.99，擬合程度較好。根據(jù)標準曲線計算出最終的酶活，單位為U/mL。
固體法測蛋白酶活力通過觀察菌落在乳粉瓊脂平板和熟雞肉瓊脂平板（cooked-chicken juice agar，CJA）上呈現(xiàn)出的分解圈大小，確定蛋白酶活力強弱。乳粉瓊脂平板制法參考ELEGBELEYE等方法；CJA平板參考王光宇的生雞肉瓊脂平板（raw-chicken juice agar，RJA）法并改進。
乳粉瓊脂平板：分別配制15%脫脂牛奶和LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分開滅菌后以1:9的比例混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿制成乳粉瓊脂平板。
CJA：將熟制后的雞胸肉與0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.2）以1:40（W/V）的比例勻漿（6000×g，3 min）；勻漿液過濾后將濾液與等體積的3%瓊脂溶液充分混合，滅菌完成后倒入無菌培養(yǎng)皿制成熟雞肉瓊脂平板。
取活化好的菌液5μL滴加到乳粉瓊脂平板和CJA上，分別放置于20℃和37℃下培養(yǎng)。每24 h觀察記錄菌落生長情況和分解圈形成。
1.2.3.2脂肪酶活力測定
取活化后的菌液，向脂酶細菌微量生化鑒定管注入10μL菌液，注入菌液時盡量使菌液流過鑒定管內(nèi)的培養(yǎng)基斜面，充分與指示劑混合后用封口膜密封生化鑒定管。按照試劑盒說明書，將鑒定管置于37℃培養(yǎng)48 h，并與空白組對比，觀察顏色變化。
1.2.3.3淀粉酶活力測定
取活化菌液5μL滴加到淀粉瓊脂平板上，分別放置于20℃和37℃下培養(yǎng)。每24 h取樣，用盧戈氏碘液染色，觀察記錄菌落生長情況和分解圈形成。
1.3數(shù)據(jù)處理
試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft office軟件進行數(shù)據(jù)整理，每個指標重復3次，采用平均值±標準差形式表示；分解圈面積采用Image J軟件進行計算；用IBM SPSS Statistics 2進行統(tǒng)計分析，采用最小顯著差數(shù)測驗法（LSD）檢驗不同處理組之間的顯著性水平（P<0.05），采用Origin2019b作圖。
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