2.4不同溫度固態(tài)發(fā)酵高粱揮發(fā)性化合物差異分析


為找出不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵高粱的特征差異化合物，運用偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)對比了45℃和50℃條件下發(fā)酵高粱的揮發(fā)性化合物結構。結果顯示，2種溫度條件下揮發(fā)性化合物結構差異顯著(P<0.01)(圖8A)。經過200次置換驗證，R2大于Q2且Q2的起點為負數，該參數證明PLS-DA模型是可靠的(圖8B)。根據變異權重參數值(variable importance in projection,VIP)大于1篩選特征差異化合物，共篩選到27種，使用Z-score標準化每種揮發(fā)性化合物并繪制聚類熱圖(圖8C)。45℃條件下癸酸乙酯、苯乙酸乙酯和棕櫚酸乙酯等酯類物質含量更高，在45℃條件下含量隨著發(fā)酵天數的增加而升高，而50℃則呈現相反趨勢，推測45℃條件下利于酯類物質的合成。50℃條件下酮類和酸類物質含量更高，如5-甲基-2-己酮、4,6-二甲基-2庚酮、環(huán)己酮、異丁酸、己酸等，推測50℃條件下更利于象牙色克羅彭斯特德菌代謝產生酮類和酸類物質。

圖8不同溫度發(fā)酵高粱風味物質差異分析

A：PLS-DA模型.B：200次置換檢驗.C：特征差異物質聚類熱圖


2.5不同發(fā)酵天數固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性化合物差異分析


為找出不同發(fā)酵天數存在的特征差異化合物，分別對菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615、K.eburnea 6E22發(fā)酵高粱揮發(fā)性物質進行不同發(fā)酵天數的差異分析，PLS-DA顯示揮發(fā)性化合物組成特點差異顯著(P<0.05)(圖9A)。經過200次置換驗證，R2大于Q2且Q2的起點為負數，該參數證明PLS-DA模型是可靠的(圖9B)。使用VIP值大于1篩選出26種特征差異物質，使用Z-score標準化每種揮發(fā)性化合物并繪制聚類熱圖(圖9C)。1-烯-3-辛醇、2,3-二氫苯并呋喃和糠醛等在發(fā)酵第0天含量最高，糠醛被認為與醬香型白酒基酒焦糊味正相關。苯甲醛、α-松油醇和2-甲基吡嗪類物質在發(fā)酵第4天或第7天含量最高。α-松油醇是萜烯類化合物，具有松木香，是醬香型白酒中重要的香氣成分，可以讓酒體更加優(yōu)雅細膩。萜烯類、吡嗪類化合物可能在發(fā)酵過程中作為前體物質被轉化為其他物質，有研究通過全基因組數據挖掘發(fā)現放線菌糖萊斯氏菌(Laceyella sacchari)具有四甲基吡嗪生物合成的完整途徑。苯乙醇、異戊酸、異丁酸、乙酸苯乙酯和棕櫚酸甲酯等在發(fā)酵第15天時含量最高。乙酸苯乙酯和棕櫚酸甲酯貢獻了酒體中的花香、果香風味，屬于高沸點物質，能夠延長酒體后味。結果表明，象牙色克羅彭斯特德菌在堆積發(fā)酵的不同時間階段能積累不同的風味化合物，可為生產中通過控制堆積發(fā)酵時間調控象牙色克羅彭斯特德菌的生長代謝提供理論參考。

圖9不同發(fā)酵天數高粱風味物質差異分析

A：PLS-DA模型.B：200次置換檢驗.C：特征差異物質聚類熱圖


3、結論


高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產中必不可少的關鍵工藝環(huán)節(jié)，直接影響醬香型白酒的質量和產量。本研究針對堆積發(fā)酵過程酒醅中的優(yōu)勢細菌屬克羅彭斯特德菌屬(Kroppenstedtia)進行分離篩選和代謝特征分析。經過形態(tài)特征及16S rRNA基因測序分析，共分離獲得3株象牙色克羅彭斯特德菌(K.eburnea)。在TSB液體培養(yǎng)基45℃純培養(yǎng)條件下，3株菌在18 h進入對數生長期，32 h進入平穩(wěn)期，36 h時從菌液中檢出的揮發(fā)性化合物主要是吡嗪類，其中菌株K.eburnea 1613的2,5-二甲基吡嗪含量最高，為5.26 mg/L，K.eburnea 1613的揮發(fā)性化合物含量普遍高于其余2株菌。


參考醬香型白酒堆積發(fā)酵條件，進行了恒溫(45℃和50℃)固態(tài)發(fā)酵高粱實驗，以研究它們在堆積酒醅中的生長和代謝特點。3株菌發(fā)酵高粱中檢出的揮發(fā)性化合物總量隨發(fā)酵時間呈明顯的上升趨勢，主要為醇類和酸類，占比之和為30.72%?84.01%，50℃發(fā)酵高粱中檢出的醇類、酸類和吡嗪類物質含量均高于45℃的，而酯類物質低于45℃的。與對照相比，3株菌均促進了含量最高的醇類物質苯乙醇和吡嗪類物質的2,5-二甲基吡嗪產生，產量優(yōu)勢菌株分別是K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22；K.eburnea 1613和K.eburnea 1615在酸類物質積累上表現出明顯優(yōu)勢，主要為異戊酸，其次是己酸。


對照組中主要的醛類物質含量高于3個實驗組，固態(tài)發(fā)酵過程中醛類總量較穩(wěn)定，酮類在15 d時最高，值得注意的是，高溫有助于對照組中醛類和酮類物質的積累。菌株K.eburnea 1615在45℃發(fā)酵15 d時酮類總量最高，是對照的2.09倍。PLS-DA分析進一步顯示不同發(fā)酵溫度和時間下菌株固態(tài)發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物結構差異顯著。


本研究從菌株水平上探討了象牙色克羅彭斯特德菌的風味物質代謝特征，并分析了溫度對發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物積累的影響，為認識高溫堆積過程耐高溫微生物在醬香型白酒風味形成中的作用提供理論基礎。


醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（一）

醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（二）

醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（三）

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