白腐真菌能夠分解木質素和秸稈纖維吸引人們進行廣泛的研究。采用白腐真菌處理玉米和油菜秸稈，結果表明在發(fā)酵培養(yǎng)20 d時，油菜秸稈的木質素降解率達到58.07%；在發(fā)酵35 d時，玉米秸稈的木質素降解率達到33.62%。采用側耳菌（平菇）處理稻草秸稈，木質纖維成分比處理前降低11.94%～14.7%。利用多種菌處理秸稈，結果顯示黃孢原毛平革菌和側耳菌的木質素降解率均為27%左右，但前者纖維素的降解率為42%，而側耳菌纖維素降解率僅有18%。降低秸稈中木質素含量，而保留纖維素是處理秸稈的目標。以上研究結果表明平菇生長速度較快，可利用多種木質纖維物質生長，且要求的生存條件較低，是目前處理秸稈飼料的主要菌種之一。雖然平菇生長較快，但至少也需要20 d，所以提高菌種的生長速度和抗逆性是提高秸稈飼料營養(yǎng)價值的關鍵。紫外誘變（UV）是最簡單和常用的提高菌種生長速度和產(chǎn)酶量的真菌育種技術。


用紫外線照射糙皮側耳的原生質體篩選出高效分解秸稈的菌株08P217，處理秸稈后木質素和纖維素的降解率均提高0.7倍以上。為此，在北方氣候條件下，以生長速度較快的側耳菌為出發(fā)菌株，采用紫外誘變技術，培育生長速度較快和產(chǎn)酶量較高的菌株，以提高處理秸稈的效率，為采用白腐真菌處理秸稈飼料提供理論依據(jù)和技術參數(shù)。


1、材料與方法


1.1菌種及試劑


菌種：試驗所用平菇購于黑龍江省微生物研究所，經(jīng)過本實驗室篩選獲得優(yōu)良菌種P2。


平板與斜面培養(yǎng)基（PDA）：20%土豆汁、2%的葡萄糖、2%瓊脂，pH值自然。


初篩平板培養(yǎng)基：1%麥芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母膏、0.2%蛋白胨、0.05%MgSO4·7H2O、0.4%KH2PO4、2%瓊脂、0.5 mmol/l愈創(chuàng)木酚。


秸稈粉試管培養(yǎng)基：粉碎玉米秸稈87%(其纖維組成見表1)、小麥麩8%、石灰5%、料水比1∶2、121℃滅菌30 min，pH值自然。

表1玉米秸稈粉培養(yǎng)基纖維組成（%）


1.2試驗方法


1.2.1菌株的活化與保存


將保存的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)7 d，再轉接活化2～3次，于4℃保存?zhèn)溆谩?


1.2.2孢子懸液的制備


用鐘罩法收集孢子于無菌蒸餾水中，適當稀釋，血球板法計數(shù)，使孢子濃度為1×108個/ml，于4℃保存?zhèn)溆谩?


1.2.3紫外線誘變劑


經(jīng)過試驗確定紫外照射孢子的致死率為70%～80%時為最佳誘變劑量，將所儲備的孢子連續(xù)誘變10批，照射后在紅光燈下適當稀釋，分別涂布于PDA培養(yǎng)基中，無處理的孢子液作對照，置于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。挑選出優(yōu)先萌發(fā)且長勢良好的菌株接入斜面培養(yǎng)基。


1.2.4初選


①通過菌絲生長情況的比較，在斜面培養(yǎng)基上進行初篩，從中選出長速快于對照菌株、長勢好、菌絲粗壯潔白的菌株與親本進行拮抗試驗，挑選拮抗程度較大的菌株。


②用打孔器將等量誘變菌株菌塊接種于初篩平板培養(yǎng)基上，從中挑選變色圈大的菌株，以出發(fā)菌為對照。結合生長和產(chǎn)酶兩個因素，表現(xiàn)突出的誘變菌株進入復選。


1.2.5復選


1.2.5.1 PDA試管菌株長速的比較


將篩出的菌株在培養(yǎng)基上傳代3次，取等量菌塊接種于斜面PDA試管，以出發(fā)菌為對照，每株菌5個重復，25℃下恒溫避光培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)長齊后劃線，以游標卡尺（精確度0.02 mm）測量各菌菌絲的生長速度。


1.2.5.2酶活性及纖維降解率比較


將篩選出的菌種按試驗分組接種到秸稈粉試管，以出發(fā)菌為對照，每株菌5個重復，在25℃恒溫避光培養(yǎng)，菌絲20 d都長滿秸稈粉試管，于此時進行相關的測定。參照鞏競的方法，取復篩菌株試管秸稈粉各4 g，打碎，混勻，加雙蒸水40 ml，置于4℃冰箱中浸提過夜；次日，用4層紗布過濾離心，取上清即得粗酶液，4℃低溫保藏。其殘渣65℃下烘至恒重用于粗纖維成分的測定。


1.3測定指標及方法


致死率(%)=[對照菌數(shù)量(cfu)-處理后菌數(shù)量(cfu)]/對照菌數(shù)量（cfu）×100；


菌絲生長速度（mm/d）=菌絲長度（mm）/菌絲生長時間（d）。


木質素過氧化酶（LiP）酶活的測定：采用亞甲基藍法；漆酶（Lac）酶活的測定：采用鄰聯(lián)甲苯胺法；纖維素酶酶活的測定：采用DNS法。


發(fā)酵秸稈纖維成分的測定：采用ANKOM220 Fiber Analyzer儀器，按照Van Soest分析法，分析中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、半纖維素（HCEL）、纖維素（CEL）和木質素（ADL）。


1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計


試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 17.0軟件中的One-Way ANOVA過程進行單因素方差分析，Duncan's法進行各組間多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。



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