金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種引起人和動物感染的重要致病菌，能夠引起皮膚、肺等局部感染以及敗血癥、膿毒癥等全身性感染性疾病，嚴重可致死亡，威脅著人類和動物健康。
盡管目前研究表明PVL在金黃色葡萄球菌致病性中發(fā)揮著重要作用，但該毒力因子具體的致病機理還不十分明確，本實驗以金黃色葡萄球菌ATCC 49775株為研究對象，利用同源重組的方法構建PVL基因敲除菌株，并對敲除菌株的穩(wěn)定性和生長特性進行評價，為進一步闡明金黃色葡萄球菌PVL的致病機理奠定基礎。
實驗內容
敲除菌株和回補菌株體外生長曲線的測定
將敲除菌株ΔPVL、回補菌株CΔPVL與金黃色葡萄球菌ATCC 49775 37℃在TSB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min培養(yǎng)，每隔30 min取200μL菌液測定一次OD600nm值，試驗重復3次，繪制3種菌株的生長曲線。
實驗結果
圖1敲除菌株ΔPVL、回補菌株CΔPVL與金黃色葡萄球菌ATCC 49775生長速率的比較
在相同條件下分別培養(yǎng)敲除菌株ΔPVL、回補菌株CΔPVL與金黃色葡萄球菌ATCC 49775（WT），根據OD600nm值繪制生長曲線。結果顯示，ΔPVL在體外生長較慢并且其生長速率顯著低于ATCC 49775野生菌，在培養(yǎng)2 h～4.5 h生長速率差異顯著，CΔPVL在體外生長速率與ATCC 49775野生菌基本一致（圖1）（p<0.01）。表明，PVL基因的缺失可能影響了金黃色葡萄球菌ATCC 49775的生長速率，推測PVL的合成與金黃色葡萄球菌的生長性能相關。
討論
PVL由LukS-PV和LukF-PV這兩個共轉錄基因組成，其首次在金黃色葡萄球菌ATCC 49775中被發(fā)現(xiàn)，是一種對人類和兔子多核型白細胞具有高度特異性的白細胞素[8]。PVL作為金黃色葡萄球菌的毒力因子，在金黃色葡萄球菌中并不常見，因此對于PVL的潛在威脅知之甚少[4]。目前已有研究報道PVL與原發(fā)性皮膚感染和肺炎有關[3]，并且對其在皮膚、大腦、呼吸系統(tǒng)和肌肉骨骼等器官或系統(tǒng)的研究結果顯示，PVL逐漸成為一種新的全球公共衛(wèi)生威脅[9-11]。
在對病原微生物的研究中，靶基因的置換或缺失是確定該基因功能、闡明其致病機理的重要手段[12]。目前，利用同源重組的方法對目標基因敲除是研究細菌單基因功能的常用方法，在革蘭氏陰性菌中廣泛應用。
本研究分別以溫敏型質粒pBT2和穿梭質粒pLI50為載體，利用同源重組的方法構建了金黃色葡萄球菌ATCC 49775 PVL的基因敲除菌株和該基因的回補菌株。在構建的敲除質粒中引入ermB基因作為抗性篩選標記，使其具有紅霉素抗性，同源重組后一方面將紅霉素抗性基因引入ATCC 49775野生菌株中，使重組菌株獲得紅霉素抗性，進而利用紅霉素篩選陽性重組菌；另一方面，ermB基因整合替換了野生菌株中的PVL基因，進而完成了對PVL基因的敲除。
此外，通過對敲除菌株ΔPVL和回補菌株CΔPVL體外生長特性的測定表明ΔPVL與野生型ATCC 49775菌株相比生長速率顯著下降，回補菌株CΔPVL與野生型ATCC 49775菌株生長速率基本一致，目前還無PVL基因與金黃色葡萄球菌的生長代謝相關的研究報道。本研究表明，PVL基因可能與金黃色葡萄球菌的生長調節(jié)有關，具體機制還需要進一步研究。
本研究構建的金黃色葡萄球菌ATCC 49775的敲除菌株，為進一步研究PVL基因的功能及其在金黃色葡萄球菌感染中的致病機理奠定了基礎。
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