研究簡介
根尖性牙周炎主要由口腔微生物感染引發(fā)，并與多種危險(xiǎn)因素有關(guān)。雖然，作為根尖牙周炎治療的主流，根管治療（RCT）可能會(huì)失敗并導(dǎo)致治療后牙髓病。隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中存活的微生物是PTED的主要原因（Siqueira和Rocas，2009年）。糞腸球菌因其高達(dá)77%的高檢測頻率而被認(rèn)為是PTED的主要病原體（.根管治療后的牙髓?。≒TED）是根管治療失敗的主要表現(xiàn)，糞腸球菌和白色念珠菌是PTED中最常被檢出的微生物組合之一。以往研究表明這兩種微生物之間存在相互作用，但其具體機(jī)制尚不明確。
胞外囊泡（EVs）作為微生物間通訊的重要媒介，在調(diào)控病原體毒力、代謝過程和耐藥性等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究旨在探討白色念珠菌來源的EVs對(duì)糞腸球菌生長和致病性的影響。研究通過超速離心法從白色念珠菌ATCC 90028的培養(yǎng)上清液中提取EVs，并通過透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）和納米顆粒跟蹤分析（NTA）對(duì)其形態(tài)、尺寸和蛋白濃度進(jìn)行鑒定。采用生長曲線、菌落形成單位計(jì)數(shù)、掃描電鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡等技術(shù)，系統(tǒng)評(píng)估了不同濃度EVs（0.156μg/mL和5μg/mL）對(duì)糞腸球菌浮游生長、生物膜形成、耐惡劣環(huán)境能力、牙本質(zhì)小管侵入能力以及在牙膠尖上定植能力的影響。此外，還通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)和巨噬細(xì)胞感染模型，分析了EVs對(duì)糞腸球菌細(xì)胞侵襲性和細(xì)胞毒性的調(diào)控作用。本研究首次系統(tǒng)揭示了白色念珠菌EVs在調(diào)控糞腸球菌致病性中的雙重作用，為理解真菌-細(xì)菌跨界互作提供了新的分子機(jī)制。
Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀用于精確評(píng)估白色念珠菌胞外囊泡（EVs）對(duì)糞腸球菌（Enterococcus faecalis）浮游生長的影響。將糞腸球菌懸液（最終濃度為1×10^6 CFU/mL）與不同濃度的白色念珠菌EVs（0.039-5μg/mL）混合后，取200μL混合物接種于96孔板中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置以等量PBS處理的細(xì)菌作為對(duì)照組。板孔表面覆蓋100μL礦物油以防止蒸發(fā)，隨后將96孔板置于Bioscreen C Pro全自動(dòng)生長曲線分析儀中，在37°C條件下連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀以每小時(shí)自動(dòng)測量各孔在600nm波長下的光密度（OD600）值，通過這種高頻次、自動(dòng)化的監(jiān)測方式，獲得了糞腸球菌在不同濃度EVs處理下的完整生長動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。這種實(shí)時(shí)監(jiān)測方式避免了傳統(tǒng)手工取樣可能帶來的污染和誤差，確保了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
白假絲酵母EV是具有雙層膜的納米顆粒，峰徑分別為111.9和230 nm。EV對(duì)糞腸桿菌及其生物膜表現(xiàn)出復(fù)雜的影響;5μg/mL的EV顯示出抑制作用，而0.156μg/mL的EV促進(jìn)其生長。EVs對(duì)糞腸桿菌毒力表現(xiàn)出一致的影響。值得注意的是，5μg/mL的EVs降低了糞腸桿菌對(duì)RAW264.7細(xì)胞的損傷，以及糞腸桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞的侵襲能力和巨噬細(xì)胞吞噬后糞腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)存活能力，而0.156μg/mL的EVs則具有完全相反的效果。白假絲酵母EVs對(duì)糞腸桿菌的體外生長和毒力具有雙重影響，表明白色念珠菌EV參與真菌-細(xì)菌通訊。此外，5μg/mL EVs在體外表現(xiàn)出的抑制作用可能提示一種控制糞腸桿菌的新藥物。
圖1、白色念珠菌ATCC 90028中EV的鑒定。(a)白色念珠菌EVs的透射電鏡。比例尺，100nm。(b)白色念珠菌EVs的掃描電鏡。比例尺，500納米。(c)通過納米顆粒追蹤分析(NTA)測量的白色念珠菌EV的大小分布范圍。紅色箭頭表示白色念珠菌EV。
圖2 、白色念珠菌EVs對(duì)浮游糞腸球菌具有雙重作用。(a)不同濃度的白色念珠菌EVs處理后糞腸球菌的生長曲線。(b)不同時(shí)間點(diǎn)白色念珠菌EVs對(duì)糞腸球菌的影響。(c)在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)用不同濃度的EV處理的糞腸球菌CFU。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns，無顯著性。
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