長(zhǎng)期以來(lái)，飼用抗生素在保障動(dòng)物健康、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料利用率等方面取得明顯的效果，給畜禽生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但是也帶來(lái)一系列問(wèn)題，如耐藥性、藥物殘留量和腸道內(nèi)菌群混亂等，受到社會(huì)的重視。我國(guó)畜禽源病大腸桿菌在耐藥率、耐藥水平上均顯著高于其它國(guó)家，已成為耐藥性最為嚴(yán)重的國(guó)家之一[1]。并且出現(xiàn)多重耐藥性的問(wèn)題，繼續(xù)濫用抗生素只會(huì)使耐藥率不斷提高。目前，歐盟多個(gè)國(guó)家均禁止使用飼用抗生素，中國(guó)對(duì)飼用抗生素的管理與應(yīng)用也更加嚴(yán)格，所以，開(kāi)發(fā)代替抗生素的綠色飼料添加劑成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。而丁酸自從被列入《添加劑品種目錄》后，漸漸被人們認(rèn)知，大量學(xué)者開(kāi)始對(duì)丁酸進(jìn)行研究。
在飼料行業(yè)中，丁酸作為一種生物調(diào)節(jié)劑，可替代部分抗生素，起到酸化、電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)、胃腸道微生態(tài)平衡調(diào)節(jié)、誘食等作用[2]。目前對(duì)丁酸的抑菌情況、作為添加劑及其添加劑量的報(bào)道相對(duì)較少，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定丁酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，檢測(cè)丁酸能否抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，以醋酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響作為對(duì)照，為丁酸代替飼用抗生素的研究提供一些依據(jù)。
1、材料與方法
1.1試驗(yàn)材料純丁酸，由龍巖新奧生物科技有限公司贈(zèng)送；MH瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯、麥康凱瓊脂，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；醋酸、大腸桿菌ATCC 25922、蒸餾水等。
1.2大腸桿菌ATCC 25922的復(fù)活在超凈臺(tái)內(nèi)操作，將大腸桿菌ATCC 25922凍干菌株啟封后，用接種環(huán)蘸取少量菌種到麥康凱培養(yǎng)基中，待菌種溶解后分區(qū)進(jìn)行涂劃得到單菌落，放入隔水式恒溫培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜培養(yǎng)。在麥康凱平板上挑選一個(gè)大腸桿菌ATCC 25922單菌落，接種到裝有3 mL LB肉湯的試管中，放入37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)4~6 h，長(zhǎng)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期最佳。
1.3藥液的配制先用純丁酸、醋酸制備4%丁酸、醋酸母液。分別吸取4%丁酸、醋酸40μL加入到EP管中，再加入960μL高壓過(guò)的蒸餾水，混勻后吸500μL到下一個(gè)EP管中，加入500μL蒸餾水混勻，以此類推，得到濃度為4%、2%、1%、0.5%、0.25%和0.125%的丁酸和醋酸。
1.4抑菌試驗(yàn)
1.4.1牛津杯試驗(yàn)將牛津杯等試驗(yàn)用具高壓滅菌，放入電熱恒溫烘干箱烘干備用，在超凈臺(tái)內(nèi)將已滅菌的牛津杯置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置4個(gè)。MH瓊脂培養(yǎng)基溫度降到50℃時(shí)，將MH瓊脂培養(yǎng)基倒入燒杯中，加入200μL菌液（1 000倍稀釋），混勻后倒板，每個(gè)板約20 mL。培養(yǎng)基凝固后，小心取出牛津杯，最后把濃度為4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的丁酸、醋酸加100μL到對(duì)應(yīng)的牛津杯孔中，每個(gè)濃度制作一個(gè)平行。靜置2 h后，培養(yǎng)皿在37℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中正放培養(yǎng)8~12 h，培養(yǎng)好后觀察測(cè)量不同濃度丁酸、醋酸的抑菌圈。
1.4.2大腸桿菌OD值測(cè)定取不同量丁酸和醋酸加入LB肉湯中，配成濃度為0.1%、0.075%、0.05%、0.025%的LB肉湯，另做空白對(duì)照組。在每瓶LB肉湯中加入50μL大腸桿菌菌液(1 000倍稀釋），混勻后吸取1.5 mL到24孔包被板中，每個(gè)濃度做一個(gè)平行，全部加完后把24孔包被板放入全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)量OD值，測(cè)完后立即放入37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔1 h使用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)量OD值，24 h后對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制成圖。
2、結(jié)果與分析
2.1不同濃度丁酸、醋酸的抑菌圈將濃度為4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的丁酸、醋酸加入到牛津杯制作出來(lái)的孔中，正置培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈直徑（見(jiàn)圖1、表1）。濃度為4%、2%、1%和0.5%的丁酸、醋酸對(duì)大腸桿菌均有抑菌作用，其中4%丁酸、醋酸的抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別達(dá)到22 mm、28 mm，其余未出現(xiàn)明顯抑菌圈。抑菌圈直徑隨著丁酸、醋酸濃度升高而明顯增大，相同濃度下醋酸的抑菌效果比丁酸好。
圖1不同濃度丁酸和醋酸對(duì)大腸桿菌的抑菌圈
表1各濃度丁酸和醋酸對(duì)大腸桿菌的影響
2.2大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線圖對(duì)濃度為0.1%、0.075%、0.05%、0.025%的丁酸和醋酸作用24 h的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制成圖（見(jiàn)圖2-圖3）。0.1%丁酸組的大腸桿菌生長(zhǎng)極其緩慢，OD值基本不變；0.075%丁酸組的大腸桿菌在19 h前生長(zhǎng)緩慢，20 h開(kāi)始輕微增長(zhǎng)，最終OD值約達(dá)0.1；0.05%丁酸組的大腸桿菌生長(zhǎng)明顯被推遲，但是后期有明顯增長(zhǎng)，OD值接近對(duì)照組；0.025%丁酸組的OD值增長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組相似，大腸桿菌生長(zhǎng)沒(méi)有受到明顯抑制，最終OD值達(dá)約1.45。醋酸組與丁酸組結(jié)果相似，但在濃度為0.05%時(shí)有差距，醋酸組在該濃度沒(méi)有出現(xiàn)明顯對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且最終OD值約0.85，僅為對(duì)照組的一半左右。以上結(jié)果表明：丁酸、醋酸對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，且濃度越高，對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響越大。
圖2丁酸作用下大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線
圖3醋酸作用下大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線
3、討論
本試驗(yàn)檢測(cè)了丁酸、醋酸對(duì)大腸桿菌ATCC 25922的抑制效果。試驗(yàn)參考張含薇等[3]采用的牛津杯法，先把菌液加入MH瓊脂培養(yǎng)基中混勻，再進(jìn)行倒板，沒(méi)有采用傳統(tǒng)的先倒板再用涂布器涂布菌液，減少了涂布器涂布不均勻或者涂布過(guò)厚引起的誤差。培養(yǎng)8~12 h后可以看到細(xì)菌分布均勻，濃度為4%、2%、1%和0.5%的丁酸、醋酸有明顯的抑菌圈，由結(jié)果可知丁酸與醋酸一樣對(duì)細(xì)菌都有一定的抑制作用，并且濃度越高抑菌效果越好。不同濃度丁酸的抑菌圈直徑分別為4%（22 mm）、2%（18 mm）、1%（13 mm）、0.5%（9 mm），證實(shí)了丁酸對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用，且濃度越高抑制效果更佳。使用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)菌菌液進(jìn)行OD值測(cè)定，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明丁酸和醋酸對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線具有一定的影響，并且隨著濃度的升高影響更明顯，濃度為0.1%時(shí)影響最大，基本上抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)。
短鏈脂肪酸主要有乙酸、丙酸和丁酸，本試驗(yàn)測(cè)定了丁酸、醋酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，發(fā)現(xiàn)丁酸和醋酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線均有影響，在牛津杯試驗(yàn)中也都產(chǎn)生明顯的抑菌圈，同等濃度下醋酸的抑菌圈會(huì)稍微大些。在短鏈脂肪酸中丁酸起主要作用，丁酸既溶于水也溶于脂類，總體來(lái)說(shuō)比較親脂，在pH4~6的酸性環(huán)境下也很難被分解，所以，丁酸被動(dòng)物攝入后可以避過(guò)小腸的酸性環(huán)境，進(jìn)入動(dòng)物的盲腸、結(jié)腸中繼續(xù)發(fā)揮其重要作用。對(duì)肉雞、仔豬的研究也表明，丁酸能夠降低腸道pH，使腸道的環(huán)境變成適合乳酸菌等有益菌生長(zhǎng)的酸性環(huán)境，添加酸化劑可以使動(dòng)物腸道中乳酸桿菌的數(shù)量增加，降低大腸桿菌的數(shù)量，使腸道的微生物區(qū)系得到優(yōu)化[4-5]。使用高脂飼料喂小鼠，結(jié)果顯示丁酸鈉可以使小鼠失調(diào)的腸道微生態(tài)得到恢復(fù)，從而減少脂肪肝的發(fā)生[6]。丁酸具有游離性和揮發(fā)性，因此，飼料生產(chǎn)中一般將丁酸制成穩(wěn)定的鈉鹽-丁酸鈉，丁酸鈉的流動(dòng)性較好，無(wú)污染、無(wú)殘留，易與其它飼料混合，而且不會(huì)改變飼料的pH，將來(lái)在飼料工業(yè)上必能發(fā)揮更好的作用。
仔豬在斷乳后的2 d內(nèi)，回腸乳酸菌數(shù)量急劇下降，大腸桿菌數(shù)量明顯增加，導(dǎo)致仔豬容易患大腸桿菌病。為了減少仔豬腹瀉，常在斷乳仔豬飼料中加入高劑量氧化鋅，高鋅飼料能夠在早期斷乳仔豬生長(zhǎng)性能及防止腹瀉方面起到顯著的效果。張文麗[7]報(bào)道在仔豬飼料中加入高劑量氧化鋅，能夠在一定程度上促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)速度并提高仔豬的日采食量。王超[8]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)在生長(zhǎng)早期仔豬飼料中添加高劑量鋅可以促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)。但長(zhǎng)期使用高鋅飼料，會(huì)造成豬肉質(zhì)量下降、豬肉中的鋅殘留量會(huì)過(guò)高。所以，在飼料行業(yè)中，很多研究者嘗試用丁酸鈉代替高劑量氧化鋅，并取得一定效果。Manzanilla E G等[9]在早期斷乳仔豬日糧中加入0.1%丁酸鈉，可以大大降低腹瀉率，尤其是斷乳后7 d。大量研究表明，使用丁酸鈉代替飼料中的高劑量氧化鋅，能夠大大降低斷乳仔豬腹瀉的發(fā)生，還可以增強(qiáng)斷乳仔豬的抵抗力，提高斷乳仔豬的采食量，促進(jìn)斷乳仔豬快速生長(zhǎng)，提高斷乳仔豬的健康水平。
4、結(jié)論
本試驗(yàn)表明，丁酸與醋酸類似，具有一定的抑菌效果，不同濃度產(chǎn)生的抑菌作用各不相同，藥物濃度越高，影響越大。丁酸鈉濃度達(dá)0.1%時(shí)，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線影響最大，大腸桿菌的生長(zhǎng)基本受到抑制，因此，可以通過(guò)在飼料中添加丁酸鈉達(dá)到抑制細(xì)菌的目的，為應(yīng)用飼料添加劑抑制細(xì)菌提供參考。
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