2.3.茶多酚
使用中性pH條件下的云南普洱茶乙酸乙酯/水多酚提取物。純酚類和芳香化合物，包括表兒茶素、兒茶素、3,4,5-三羥基苯甲酸（沒(méi)食子酸）、3,4-二羥基肉桂酸（咖啡酸）、3-（4-羥基苯基）丙酸、3-苯基丙酸和4-羥基苯乙酸購(gòu)自Sigma-Aldrich，而3-氧-甲基沒(méi)食子酸購(gòu)自extrasynthese。
2.4.腸道細(xì)菌培養(yǎng)
將培養(yǎng)基和添加了0.1%（w/v）芳香化合物的培養(yǎng)基接種5%（v/v）的細(xì)菌培養(yǎng)物，并分別在37°C有氧和厭氧條件下培養(yǎng)。按傳統(tǒng)方式?jīng)_泡的濃云南普洱茶中芳香化合物的濃度估計(jì)約為0.1%（w/v）。在添加酚類后的0小時(shí)和24小時(shí)對(duì)細(xì)菌上清液進(jìn)行取樣。在13600 g離心10分鐘后收集細(xì)菌細(xì)胞沉淀，并洗滌以去除從上清液中攜帶的任何痕量酚類。在初步研究中證實(shí)了徹底的洗滌程序，其中對(duì)照沉淀物接種了標(biāo)準(zhǔn)酚類混合物。
2.4.1.酚類和芳香化合物的提取
將100微升上清液用濃鹽酸酸化（最終鹽酸濃度為2%，v/v），并在提取前加入5納摩爾內(nèi)標(biāo)。將細(xì)胞沉淀進(jìn)行超聲處理以裂解細(xì)胞，釋放吸附在細(xì)菌上或進(jìn)入細(xì)菌的任何酚類。細(xì)胞裂解液離心后按上述方法處理。將酸化的樣品上樣到含有硅藻土的固相萃取柱上，隨后使用1.8毫升乙酸乙酯洗脫。
2.4.2.衍生化
所有樣品的衍生化均按先前描述進(jìn)行。基本上，向樣品中加入10微升甲硅烷基化級(jí)乙腈，然后加入50微升含1%三甲基氯硅烷的雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺。在室溫下孵育3小時(shí)允許酚類物質(zhì)完全衍生化。
2.4.3.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析
通過(guò)各種細(xì)菌產(chǎn)生的酚類代謝物的分析通過(guò)GC-MS進(jìn)行。將衍生化樣品通過(guò)連接有Hewlett Packard 5890II氣相色譜儀的Hewlett Packard 5973質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行分析，配備自動(dòng)進(jìn)樣器和計(jì)算機(jī)工作站。進(jìn)樣口、MS離子源和GCMS接口溫度分別保持在280°C、230°C和290°C。分離在熔融石英毛細(xì)管柱上進(jìn)行，該柱涂有交聯(lián)的5%苯基甲基聚硅氧烷。
氦氣為載氣，流速為1毫升/分鐘。將1微升衍生化樣品以8:1的分流比注入GC進(jìn)樣口。柱溫在100°C保持1.5分鐘后，以10°C/分鐘的速度升至140°C，然后在140°C保持2分鐘，再以15°C/分鐘的速度升至150°C。溫度進(jìn)一步以2°C/分鐘的速度升至160°C，然后以15°C/分鐘的速度升至215°C，接著以20°C/分鐘的速度升至262°C，并保持4分鐘。最后，溫度以10°C/分鐘的速度升至290°C，并在290°C保持3分鐘。使用電子轟擊離子化模式在70 eV下進(jìn)行選擇離子監(jiān)測(cè)，離子源溫度保持在230°C。通過(guò)將化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積相關(guān)聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)芳香族化合物的定量。
2.4.4.測(cè)定茶多酚對(duì)腸道細(xì)菌生長(zhǎng)的影響
為了監(jiān)測(cè)需氧菌的生長(zhǎng)，將5%的接種物接種到含有0.1%相應(yīng)酚類的肉湯中。使用微生物讀數(shù)儀在37°C下每10分鐘測(cè)量420至580 nm處的吸光度，持續(xù)24小時(shí)。將生長(zhǎng)與對(duì)照（無(wú)茶多酚）進(jìn)行比較，以確定不同酚類化合物的活性。
對(duì)于厭氧菌生長(zhǎng)的測(cè)定，將5%的接種物在試管中培養(yǎng)，并在厭氧條件下在24小時(shí)內(nèi)監(jiān)測(cè)光密度讀數(shù)。在0、3、6、9、12和24小時(shí)使用試管分光光度計(jì)在550 nm處讀取OD值。將生長(zhǎng)與對(duì)照（無(wú)茶多酚）進(jìn)行比較，以確定特定酚類的影響。
3.結(jié)果
通過(guò)GC-MS檢測(cè)到的發(fā)酵普洱茶提取物中31種不同酚類和芳香族化合物的水平如表1所示。茶提取物中存在的主要酚類化合物，包括表兒茶素、兒茶素、3-氧-甲基沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸和咖啡酸，在與糞便細(xì)菌勻漿孵育后濃度下降（表2），而其他測(cè)量到的芳香族衍生物，包括3-苯基丙酸和4-羥基苯乙酸，則有所增加。因此，我們更準(zhǔn)確地檢查了這7種芳香族化合物，以及先前已被鑒定為多酚細(xì)菌代謝物的3-（4-羥基苯基）丙酸，研究它們對(duì)各種腸道細(xì)菌物種生長(zhǎng)的影響。
表1：茶提取物中多酚成分的濃度分布
茶多酚成分 茶提取物中的濃度 (nmol/g)
苯乙酸 0.29
3,4,5-三甲基羥基苯甲酸 0.01
3-苯基丙酸 0.07
4-乙基苯甲酸 0.5
3,4-甲基羥基苯酚 0.02
4-羥基,3-甲基苯甲醛 0.03
反式肉桂酸 0.01
1,2,3-三羥基苯甲酸 0.78
3,4-二羥基苯甲醛 0.06
4-羥基苯乙酸 0.04
1,3,5-三羥基苯甲酸 5.41
3-(4-羥基苯基)丙酸 0.01
4-羥基,3-甲基羥基苯甲酸 0.01
3-羥基,4-甲基羥基苯甲酸 0.01
3,4-二羥基苯甲酸 0.18
3,4-二苯基乙酸 0.01
4-氧-甲基沒(méi)食子酸 0.4
4-羥基肉桂酸 0.63
3-氧-甲基沒(méi)食子酸 33.97
3,4,5-三甲基羥基肉桂酸 0.09
3,4,5-三羥基苯甲酸 (沒(méi)食子酸) 81.22
3-羥基,5-甲基羥基肉桂酸 0.01
3,4-二羥基肉桂酸 (咖啡酸) 5.70
柚皮素 0.26
鷹嘴豆素A 1.78
表兒茶素 44.86
兒茶素 47.04
染料木素 0.76
芒柄花素 0.01
山奈酚 0.54
槲皮素 4
表2：茶提取物與糞便細(xì)菌孵育24小時(shí)后主要酚類成分的濃度變化
在測(cè)試的每種細(xì)菌中觀察到八種芳香族化合物的不同生長(zhǎng)效應(yīng)（表3和表4）。在大多數(shù)細(xì)菌物種中最常見的反應(yīng)是芳香族化合物對(duì)生長(zhǎng)的抑制，但程度取決于細(xì)菌種類和芳香族化合物。與其他酚類相比，咖啡酸通常對(duì)測(cè)試的各種細(xì)菌產(chǎn)生更顯著的生長(zhǎng)抑制。在極少數(shù)細(xì)菌物種中觀察到生長(zhǎng)刺激，并且僅由一種或兩種芳香族化合物引起，但共生梭菌（MD024）和腸炎沙門氏菌ATCC 13076除外，它們的生長(zhǎng)分別被七種和五種不同的芳香族化合物促進(jìn)。
相關(guān)新聞推薦
1、寧夏引黃灌區(qū)稻蟹共作(EG)土壤理化指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定（二）
2、雞大腸桿菌在不同限鐵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及對(duì)空腸彎曲菌的作用（二）
3、米酒釀造過(guò)程釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用及工藝優(yōu)化研究