SDS-PAGE和Western印跡。 從在BHI培養(yǎng)基中指數生長期中期收獲的細胞沉淀制備變形鏈球菌的蛋白質提取物，并用Tris緩沖鹽水洗滌兩次。通過在玻璃珠存在下，在SDS煮沸緩沖液中使用珠磨機進行機械破碎，如先前描述制備蛋白質提取物。也將細菌細胞懸浮于4% SDS中，并在室溫下孵育1小時以提取表面相關蛋白質。離心后，上清液用作4% SDS提取物。蛋白質通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在含有4.5%堆積膠的10%聚丙烯酰胺凝膠中分離，如Laemmli所述。然后蛋白質用考馬斯藍染色或印跡到Immobilon-P膜上，并進行Western印跡分析的標準技術。膜與針對全長純化重組AtlA產生的抗-630D1多克隆抗血清一起孵育。通過二辛可寧酸測定確定樣品中的蛋白質濃度。感興趣的條帶從染色凝膠中切下，并送往Donald Danforth植物科學中心的蛋白質組學和質譜設施進行鑒定。
轉錄分析。 通過逆轉錄酶PCR檢查兩個基因共轉錄的潛力。通過實時RT-PCR定量mRNA水平。如先前描述進行RNA提取、RT-PCR和實時RT-PCR，并分析和標準化數據。用于逆轉錄反應和實時PCR的引物顯示在表1中。
結果
atlA操縱子。 我們先前證明變形鏈球菌atlA基因從至少三個啟動子轉錄，作為四基因操縱子的一部分。在atlA區(qū)域的進一步表征中，我們鑒定了一個基因，位于atlA起始密碼子上游249 bp，此處顯示能夠與atlA共轉錄。這一發(fā)現表明SMu0629基因和atlA的基因產物之間可能存在功能聯(lián)系。
圖1. 變形鏈球菌SMu0629基因座的轉錄分析。（A）atlA區(qū)域示意圖及RT-PCR分析。示意圖上方的基因命名與編號基于變形鏈球菌UA159的基因組序列信息。箭頭指示轉錄方向，箭頭內部及開放閱讀框之間的數字分別表示開放閱讀框和基因間區(qū)的堿基對長度。使用反向引物（630-antisense）進行逆轉錄后，采用629-sense和630-antisense引物組進行PCR擴增。引物退火位點如圖示。PCR產物在Tris-乙酸-EDTA凝膠中的電泳結果如下：M泳道為分子量標準；1泳道為RT-PCR產物；2泳道為未加逆轉錄酶的陰性對照；3泳道為UA159染色體DNA的PCR陽性對照。（B）由165個氨基酸組成的SMu0629蛋白序列。該序列含八個可能形成金屬結合位點的保守半胱氨酸（加粗顯示），以及硫氧還蛋白超家族多個成員活性位點特有的FX4CXXC基序（序列上方標注；第48至56位氨基酸）。
SMu0629基因長495 bp，編碼一個保守的假設蛋白，預測分子量為19,504 Da。Pfam搜索顯示，殘基51至155將SMu0629置于一個未表征的UPF0153蛋白家族中，該家族包含八個保守的半胱氨酸，被提出形成金屬結合位點。值得注意的是，SMu0629還包含一個F-X4-C-X-X-C基序。C-X-X-C基序已知是硫醇-二硫鍵氧化還原酶家族成員的活性位點，這些酶參與多種氧化還原活性，包括蛋白質還原和氧化應激耐受。鑒于AtlA在生物膜形成中的重要作用以及atlA和SMu0629基因產物之間可能存在功能聯(lián)系，我們探討了氧氣對各種變形鏈球菌菌株生長和生物膜形成的影響。
圖2. 變異鏈球菌菌株（野生型與630NP）的生長情況。(A) 在BHI肉湯中的需氧生長通過Bioscreen C系統(tǒng)監(jiān)測，該系統(tǒng)設置為每30分鐘振蕩15秒（需氧條件）。對于厭氧生長，在肉湯培養(yǎng)物表面覆蓋無菌礦物油（覆油條件）。(B) 變異鏈球菌UA159和630NP在添加蔗糖的BM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時形成的生物膜。需氧培養(yǎng)在搖床（150 rpm）中進行，厭氧培養(yǎng)則覆蓋礦物油。詳見正文。數據代表至少兩次獨立實驗（三次或以上重復）的結果。誤差棒表示標準偏差（n=6）。
氧氣對自溶和生物膜形成的影響。 為了比較變形鏈球菌在氧氣存在和不存在下的生長，在好氧和厭氧條件下在BHI培養(yǎng)基中監(jiān)測生長，如材料與方法中詳細描述。如圖2A所示，野生型和AtlA缺陷菌株的生長速率沒有觀察到差異。然而，在厭氧條件下，atlA突變體在穩(wěn)定期晚期顯示出對自溶的顯著抗性。光學顯微鏡觀察顯示，當突變體在好氧條件下生長時，未觀察到atlA缺陷菌株特征性的長鏈形成。
對于體外生物膜測定，微孔板在空氣中在旋轉搖床上在好氧和厭氧條件下生長。有趣的是，當UA159在通氣條件下生長48小時時，在補充蔗糖的BM培養(yǎng)基中形成生物膜的能力顯著受損。此外，在相同條件下，atlA突變體比野生型菌株積累了更多的生物膜生物量。當變形鏈球菌用蔗糖培養(yǎng)時，Gtf酶產生大量水不溶性葡聚糖，促進生物膜的粘附和積累。在補充葡萄糖的BM培養(yǎng)基中的生物膜形成無法研究，因為在這些條件下630NP形成生物膜的能力非常差。氧氣對生物膜形成的影響以及通過atlA突變在空氣中恢復生物膜形成表明細胞自溶可能受氧氣影響，導致變形鏈球菌形成生物膜的能力變化。我們推斷與氧氣中生長相關的這些表型可能與SMu0629作為潛在氧化還原酶的功能有關。因此，我們表征了缺乏SMu0629基因的菌株的AtlA生物發(fā)生和生長特性。
SMu0629基因突變體的構建和表征。 通過缺失和插入非極性或極性卡那霉素盒破壞SMu0629基因，創(chuàng)建菌株629NP和629P。通過實時RT-PCR確認SMu0629基因中的非極性插入允許高效通讀到atlA。從菌株629P的總RNA測量從atlA緊鄰上游轉錄產生的atlA mRNA，而不是作為與SMu0629基因共轉錄的結果。如圖3A所示，629P中的atlA mRNA比629NP或野生型少約50%，證實了基因可以共轉錄，并為SMu0629和AtlA之間可能的功能聯(lián)系提供了證據。
在BHI培養(yǎng)基中這些菌株的生長速率沒有觀察到明顯差異。還值得注意的是，在629NP或629P突變體中未觀察到atlA缺陷突變體特征性的聚集和鏈長增加。有趣的是，SMu0629基因突變體在補充葡萄糖的BM培養(yǎng)基中顯示出生物膜形成的顯著增加，與野生型菌株相比，24小時后增加25%，48小時后增加55%。然而，在BM-蔗糖中未觀察到生物膜形成的明顯差異。
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