3、結(jié)果與討論
3.1.抗真菌活性
生物膜的形成與念珠菌屬引起的慢性感染有內(nèi)在聯(lián)系。許多研究證實，固著細(xì)胞對大多數(shù)可用抗生素的敏感性降低（Mah&O'Toole，2001，Périchon，2009，de la Fuente Nunez et al.，2013）。因此，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的治療藥物至關(guān)重要。天然產(chǎn)物能夠在生物膜的所有階段干擾生物膜的形成。它們可以影響環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或干擾生物膜形成的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。所有這些過程都會干擾細(xì)胞粘附和生物膜的形成。由于天然物質(zhì)與生物膜的相互作用機(jī)制復(fù)雜且往往具有屬特異性，因此必須根據(jù)特定微生物和條件對其進(jìn)行評估和描述。
本研究選擇了已知干擾生物膜形成的天然物質(zhì)。低濃度黃芩素（4–32μg ml?1）能夠抑制白色念珠菌生物膜的形成（Cao等人，2008年，Sardi等人，2013年），殼聚糖對多種微生物具有抗菌活性，包括白色念珠菌生物膜（Carlson等人，2008年，F(xiàn)rancolini&Donelli，2010年，Martinez等人，2010年）。Pires等人（2012年）將松蘿酸描述為一種有效的副硅藻固著細(xì)胞生長抑制劑。
它們對所研究的擬青霉和克魯西青霉菌株的抗真菌活性被確定為最小抑制濃度，如表2所示。觀察到的MIC在兩種物種的通常觀察值范圍內(nèi)（Canton等人，2003年）。
表2擬青霉和克魯西青霉對兩性霉素B、黃芩素和殼聚糖的敏感性測定為MIC。
為了評估受試化合物對固著細(xì)胞的活性，進(jìn)行了一系列濃度范圍的初步實驗，有效濃度的結(jié)果如圖2所示。化合物效應(yīng)以百分比（條形圖）表示，與對照實驗相關(guān)，分配為100%，因此低于100%的值表示細(xì)胞覆蓋面積降低，超過100%的值表示物質(zhì)影響增加生物膜覆蓋的情況。評估后選擇的二值圖像（黑色區(qū)域代表生物膜）位于條形圖下方，所有圖中生物膜生物量的排列：物質(zhì)效率對抗粘附（A行）；防止生物膜形成的物質(zhì)效率（圖片B行）；針對預(yù)形成生物膜的物質(zhì)效率（圖片C行）。每幅圖像都是一組平鋪圖像，顯示了一口井的中心表面。這是Cellavista評估的25幅圖像的匯編。在所研究的天然化合物中，殼聚糖和黃芩素在低濃度下都會影響粘附或預(yù)形成的生物膜，但松蘿酸即使在300μg ml的濃度下也沒有表現(xiàn)出足夠的抗生物膜性能?因此被排除在其他試驗之外（單向方差分析：C.parasilosis粘附抑制P=0.67，生物膜發(fā)育P=0.014，預(yù)形成生物膜P=0.15）。在兩種研究微生物的所有對照實驗中，生物膜的排列是一致的。在大多數(shù)情況下，這些物質(zhì)會均勻地影響和降低覆蓋面積，但黃芩素除外，即使在總覆蓋面積降低的情況下，黃芩素的存在也會導(dǎo)致簇狀物的形成（以白色圓圈突出），尤其是在副硅藻的生物膜發(fā)育實驗中（B行，第二列）。
圖2：。所選物質(zhì)在最低抑制濃度（MIC）下對副硅藻土鏈球菌和克魯西鏈球菌生物膜形成的影響。黑條（圖像A行）：物質(zhì)抗粘附效率；深灰色條帶（圖像B行）：物質(zhì)對生物膜形成的效率；淺灰色（圖像C行）：物質(zhì)對預(yù)先形成的生物膜的效率。所有圖像都是一個代表井的瓷磚。比例尺=400μm。
3.2.抗生素對生物膜的影響
兩性霉素B是用于真菌感染的標(biāo)準(zhǔn)抗生素，但其腎毒性是這種治療中最嚴(yán)重的問題。此外，這種藥物通過細(xì)胞膜的滲透性差，這也是該藥物給患者的劑量增加的原因，這有助于真菌耐藥性的發(fā)展。與之前的研究（Baillie&Douglas，1998，Douglas，2003）一樣，我們的結(jié)果（圖3）證實，兩性霉素B促進(jìn)預(yù)先形成的生物膜的進(jìn)一步生長，而不是將其根除，但與濃度為3μg ml的對照組相比，它能夠抑制約60%的微生物粘附?1，比副硅藻土懸浮細(xì)胞的MIC高兩倍。另一方面，即使在濃度為5μg ml時，兩性霉素B也能減少克氏梭菌固著細(xì)胞預(yù)形成生物膜的定殖面積?1（懸浮細(xì)胞比MIC高兩倍）。在最高測試濃度（20μg ml）下，其對微生物粘附的抑制效果僅為35?1).兩性霉素B對所研究微生物的生物膜發(fā)育沒有顯著影響，也不影響生物膜的排列（未顯示圖像）。
圖3：。兩性霉素B對擬青霉和克魯西青霉生物膜形成的影響。黑條：抗粘附物質(zhì)效率；深灰色條形圖：物質(zhì)對生物膜形成的有效性；淺灰色：物質(zhì)對預(yù)先形成的生物膜的效率。比例尺=400μm。
3.3.天然物質(zhì)對生物膜的影響
盡管之前已經(jīng)報道了黃芩素對念珠菌屬懸浮細(xì)胞的抗真菌活性以及對白色念珠菌的抗生物膜活性（Cao等人，2008年），并且Serpa等人（2012年）和Sardi等人（2013年）研究了黃芩素對副青霉懸浮細(xì)胞的影響，但黃芩素對副青霉和克魯西青霉的抗生物膜活性數(shù)據(jù)仍然不足。
為了更詳細(xì)地評估黃芩素的抗生物膜活性，黃芩素在三個不同階段對生物膜形成的影響如圖4所示。黃芩素對所研究的每一種念珠菌菌株的效力是不同的。在副硅藻土中觀察到預(yù)成生物膜生物量的較高減少，而這并不影響生物膜的排列。即使在20μg ml濃度下，也觀察到約60%的預(yù)形成生物膜抑制?1個在副硅藻土C?1在C.krusei中（單因素方差分析，P?0.001）。在擬青霉中，觀察到黃芩素對生物膜排列和簇形成的影響（圖4中白色圓圈突出顯示的簇）。黃芩素抑制擬青霉生物膜的形成（單向ANOVA，P=0.005），但對克魯西青霉無顯著影響（單向ANOVA，P=0.074）。當(dāng)濃度低于MIC-50μg-ml時，觀察到超過30%的微生物粘附抑制?1個用于副硅藻酸桿菌，60μg ml?1對于克魯西梭狀芽胞桿菌細(xì)胞，通過單因素方差分析（P?0.001）證實了兩種微生物結(jié)果的顯著性。黃芩素在所有研究的實驗裝置（粘附、生物膜發(fā)育和預(yù)形成的生物膜）中誘導(dǎo)C krusei生物膜中的簇形成，在較高濃度的C.parasilosis中。
圖4：。黃酮類黃芩素對擬青霉和克魯西青霉生物膜形成的影響。黑條（圖像A行）：物質(zhì)抗粘附效率；深灰色條帶（圖像B行）：物質(zhì)對生物膜形成的效率；淺灰色（圖像C行）：物質(zhì)對預(yù)先形成的生物膜的效率。所有圖像都是一個代表井的瓷磚。比例尺=400μm。
殼聚糖的抗菌作用以及低分子量殼聚糖水凝膠的抗真菌和抗生物膜特性已在前面介紹過（Cobrado et al.，2013，Silva Dias et al.，2014）。殼聚糖似乎是一種非常有效的微生物粘附抑制劑或生物膜還原劑。實驗證明，殼聚糖水凝膠能夠顯著減少體內(nèi)外念珠菌生物膜的形成。盡管生物膜結(jié)構(gòu)存在巨大差異，不僅在不同物種的菌株之間，而且在同一物種的菌株之間，殼聚糖活性在同一物種內(nèi)通常是一致和恒定的（Silva Dias et al.，2014）。
使用一種新的方法——Cellavista自動顯微鏡評估和隨后的圖像分析，我們證實了準(zhǔn)硅藻土梭菌和克魯西梭菌的這一結(jié)果（圖5），并補(bǔ)充了描述殼聚糖對生物膜形成影響的數(shù)據(jù)。與之前的研究相反，我們的結(jié)果顯示，殼聚糖在明顯較低的濃度下（40μg-ml時，粘附力降低60%）對擬青霉粘附抑制有顯著的抑制作用（單向方差分析，P?0.001?1）尤其是克氏梭菌（20μg ml時下降80%）?1，經(jīng)單因素方差分析證實，P?0.001）。在物質(zhì)對生物膜發(fā)育的自然影響條件下，殼聚糖對擬青霉無影響；在生物膜生長的這一階段，殼聚糖甚至增加了克魯西鏈球菌的生物膜形成。殼聚糖對副硅藻土芽孢桿菌的清除作用最大為30%（在40μg-ml濃度下），副硅藻土芽孢桿菌僅影響預(yù)形成生物膜中的固著細(xì)胞?1）在25μg-ml濃度下，克氏貍殖吸蟲預(yù)形成生物膜的清除率為40%左右?1).殼聚糖對C.parasilosis和C.krusei生物膜的清除效果顯著（單因素方差分析，P=0.015）。
圖5：。多糖殼聚糖對擬青霉和克魯西青霉生物膜形成的影響。黑條（圖像A行）：物質(zhì)抗粘附效率；深灰色條帶（圖像B行）：物質(zhì)對生物膜形成的效率；淺灰色（圖像C行）：物質(zhì)對預(yù)先形成的生物膜的效率。所有圖像都是一個代表井的瓷磚。比例尺=400μm。
Cellavista基本上是一種自動顯微鏡，可以將單個圖像合并成更大的單位。然后，對如此創(chuàng)建的較大區(qū)域的所創(chuàng)建的構(gòu)圖進(jìn)行圖像分析。根據(jù)已發(fā)表的著作（Lindstrom et al.，2009，Duverger et al.，2013，Tomasina et al.，2013），該設(shè)備通常用于組織培養(yǎng)監(jiān)測和分析，但其特性也可有利地用于微生物生物膜的研究，微生物生物膜通常在載體上形成異質(zhì)結(jié)構(gòu)，單個顯微鏡圖像無法提供完全客觀的視圖。據(jù)我們所知，Cellavista從未用于酵母細(xì)胞粘附的量化，也從未用于研究添加抗生素和其他具有抗生物膜活性的生物活性天然物質(zhì)對生物膜形成不同階段的調(diào)節(jié)作用。Sirmerova et al.（2013）的唯一相關(guān)研究描述了使用熒光應(yīng)用的Cellavista藻類生物膜對表面的污染。
使用Cellavista自動顯微鏡和圖像分析軟件為固定細(xì)胞的鑒定和量化帶來了新的可能性，同時也為生物膜的整體表征帶來了新的可能性。在我們的研究中，通過brightfield應(yīng)用探索兩性霉素B、黃芩素和殼聚糖對酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性，記錄了這一特征。對于熒光應(yīng)用，需要40×物鏡，因此培養(yǎng)容器的底部厚度不應(yīng)超過約150–200μm。這需要專門的培養(yǎng)容器，最好是為顯微鏡指定厚度均勻的玻璃底部。因此，對于高通量篩選，我們建議在這項工作中使用brightfield應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)微孔板。我們的方法將其應(yīng)用潛力擴(kuò)展到微生物領(lǐng)域，并允許輕松監(jiān)測生物膜的形成和快速篩選生物活性化合物的效果。
綜上所述，我們已經(jīng)證明黃芩素和殼聚糖是天然物質(zhì)，能夠抑制微生物粘附到表面或破壞準(zhǔn)硅藻土鏈球菌和克魯西鏈球菌預(yù)先形成的生物膜。另一方面，兩性霉素B（通常使用真菌抗生素）促進(jìn)了副硅藻酸桿菌的生物膜形成，而不是將其根除。因此，Cellavista自動顯微鏡是一種出色的設(shè)備，顯著提高了實驗工作的效率，提供了與之前公布的程序完全可比的結(jié)果，如上所述，可以更全面地觀察生物膜。
雖然黃芩素在高濃度下表現(xiàn)出抗菌活性，但其抗生物膜活性在低10倍左右的濃度下觀察到。這是一個相當(dāng)重要的發(fā)現(xiàn)，因為之前描述的大多數(shù)物質(zhì)在較高濃度下對生物膜的作用通常比對懸浮細(xì)胞的最低抑制濃度更有效。我們認(rèn)為，黃芩素和殼聚糖可用于破壞醫(yī)療設(shè)備上的微生物生物膜，也可用于治療各種與生物膜相關(guān)的感染。感謝特定大學(xué)研究（MSMT第20/2015號）和GACR撥款14-23597S提供的財政支持。
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