【背景】糞腸球菌(Enterococcus faecalis)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧細(xì)菌，可以引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、牙髓感染和尿路感染等疾病。由于抗生素耐藥性日趨嚴(yán)重，噬菌體治療已成為一種有效針對(duì)糞腸球菌感染的替代策略。
【目的】分離針對(duì)糞腸球菌的烈性噬菌體，為開發(fā)糞腸球菌噬菌體療法奠定基礎(chǔ)。
【方法】分離出針對(duì)耐萬古霉素糞腸球菌V583的噬菌體A149，通過透射電鏡觀察噬菌體的形態(tài)，測定其最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線及溫度和pH穩(wěn)定性，并進(jìn)行全基因組測序分析，以闡釋該噬菌體的基本生物學(xué)特性；測定其裂解譜和體外抑菌曲線，并進(jìn)一步通過治療耐萬古霉素糞腸球菌腸道感染小鼠模型評(píng)價(jià)其抗菌性能。
【結(jié)果】噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)為0.001，具有短尾噬菌體科(Podoviridae)的典型形態(tài)特征。噬菌體A149在較寬的溫度范圍(20?50℃)穩(wěn)定存活，60℃滴度略有下降，70℃及以上完全失活；在pH 4.0?10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定存活，在pH 11.0時(shí)滴度略有下降，pH低于3.0或高于12.0時(shí)完全失活。噬菌體A149潛伏期短(≤5 min)，暴發(fā)量高(約912 PFU/cell)，基因組不含抗生素抗性基因和毒力基因，在體外可有效抑制糞腸球菌生長達(dá)11 h，對(duì)所測試的糞腸球菌具有86.4%的裂解能力(51/59)，在小鼠腸道感染模型中可降低糞腸球菌約1.3個(gè)數(shù)量級(jí)。
【結(jié)論】本研究表明噬菌體A149對(duì)于治療糞腸球菌感染具有一定的應(yīng)用潛力，為開發(fā)糞腸球菌噬菌體防控技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
1、簡介
糞腸球菌(Enterococcus faecalis,Efs)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧細(xì)菌，在人和各種動(dòng)物的腸道中廣泛定殖，被認(rèn)為是一種常見的腸道共生菌。但Efs也可作為機(jī)會(huì)致病菌，引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、尿道和傷口感染等疾病[1-3]。隨著抗生素的廣泛使用，Efs的耐藥性日趨嚴(yán)重，尤其是耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus,VRE)的出現(xiàn)，給臨床VRE感染的治療帶來了困難[4]。研究表明腸道內(nèi)的VRE定殖可能不會(huì)引起癥狀，但可持續(xù)存在較長的時(shí)間，成為VRE的儲(chǔ)存庫，具有引起患者和他人感染的巨大風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，開發(fā)針對(duì)VRE感染的抗生素替代方案迫在眉睫。
噬菌體是一種能夠感染并裂解細(xì)菌的病毒，可以靶向消滅特定細(xì)菌，在治療耐藥菌感染方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[6]。此外，噬菌體容易獲得，殺菌速度快，對(duì)真核細(xì)胞無害、安全，并且具有與其他抗菌藥物如抗生素、抗菌肽等的協(xié)同抗菌效應(yīng)[7-8]，是一種十分有前景的抗生素替代療法。先前的研究在城市污水、養(yǎng)殖場污水和人類糞便等各種樣本中分離出了針對(duì)Efs的多種烈性噬菌體，并且在體外和動(dòng)物模型中表現(xiàn)出較好的抗菌特性[9-11]，證實(shí)噬菌體是一種有效的抗菌劑，但噬菌體的裂解特異性決定了在治療時(shí)要進(jìn)行配型，因此要篩選足夠的噬菌體毒株，建立針對(duì)特定細(xì)菌的噬菌體資源庫。本研究分離出一株針對(duì)耐萬古霉素Efs V583的烈性噬菌體，擬測定其生物學(xué)特性，完成全基因組測序并分析，評(píng)價(jià)其在體外和體內(nèi)的抗菌能力，以期為開發(fā)Efs感染的噬菌體療法奠定基礎(chǔ)。
2、結(jié)果與分析
2.1噬菌體A149的分離純化與透射電鏡觀察
以耐萬古霉素Efs V583為宿主菌從污水樣本中分離出一株噬菌體，經(jīng)過雙層平板法對(duì)噬菌體進(jìn)行3?4次純化后，將其命名為Enterococcus phage A149。如圖1A所示，噬菌體A149的噬菌斑邊界分明，周圍無暈圈。分析透射電鏡拍攝的(圖1B)，表明噬菌體A149具有典型的短尾噬菌體科(Podoviridae)的特征，頭部直徑約為46.2 nm，尾部結(jié)構(gòu)長度約28.8 nm。從形態(tài)上觀察，噬菌體A149歸屬于有尾噬菌體綱(Caudovirales)中的短尾噬菌體科。
圖1噬菌體A149的形態(tài)A：噬菌體A149形成的噬斑；B：噬菌體A149透射電鏡形態(tài)(10 000×)。
2.2噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)
將噬菌體A149與宿主菌按照10:1、1:1、0.1:1、0.01:1和0.001:1的比例分別混合后37℃振蕩培養(yǎng)6 h，雙層平板法計(jì)算各個(gè)比例下噬菌體的效價(jià)。結(jié)果如表1所示，當(dāng)MOI=0.001時(shí)，噬菌體A149生長擴(kuò)增最佳，可達(dá)1.0×1010 PFU/mL，所以0.001為噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)。
表1噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)測定
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