2結(jié)果與討論
2.1發(fā)酵液中赤蘚糖醇和葡萄糖定性分析結(jié)果
2.1.1薄層層析分析(圖1)
1.甘油標(biāo)準(zhǔn)品2.混合標(biāo)準(zhǔn)品，自上而下為赤蘚糖醇、葡萄糖3～6.CF4發(fā)酵液7.UV3-CF4-5 8.UV4-CF4-3 9.混合標(biāo)準(zhǔn)品，自上而下分別為甘油、赤蘚糖醇10.UV3-CF4-1 11.UV3-CF4-3
對發(fā)酵液進(jìn)行薄層層析分析，薄層板上出現(xiàn)了白色斑點(diǎn)。由圖1可知，菌株CF4只產(chǎn)生甘油，經(jīng)紫外誘變后，有赤蘚糖醇產(chǎn)生。
2.1.2標(biāo)準(zhǔn)品與菌株CF4誘變前后發(fā)酵液的高效液相色譜圖(圖2、圖3)
圖2甘油標(biāo)準(zhǔn)品(A)和菌株CF4誘變前發(fā)酵液(B)的高效液相色譜圖
圖3赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品(C)和誘變菌株UV3-CF4-5發(fā)酵液(D)的高效液相色譜圖
由圖2可知，甘油的保留時(shí)間為7.10 min左右，菌株CF4誘變前只產(chǎn)甘油，與薄層層析結(jié)果一致。
由圖3可知，赤蘚糖醇保留時(shí)間為8.77 min左右，紫外誘變菌株UV3-CF4-5只產(chǎn)赤蘚糖醇，與薄層層析結(jié)果一致。
2.2菌株CF4的生長曲線(圖4)
圖4菌株CF4的生長曲線
由圖4可以看出，培養(yǎng)2～8 h期間菌體數(shù)量變化不明顯，為延滯期；10 h后菌體數(shù)量迅速增加，進(jìn)入生長期；20 h后菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，即進(jìn)入穩(wěn)定期，可見該菌株的對數(shù)生長期在10～20 h之間。因此，選取培養(yǎng)時(shí)間為16 h的菌株進(jìn)行紫外誘變。
2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線
以赤蘚糖醇濃度(g·L-1)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5。擬合得回歸方程y=75791x+18334，R2=0.999，赤蘚糖醇濃度范圍為0.5～10 g·L-1時(shí)，線性相關(guān)較好。
圖5赤蘚糖醇濃度與峰面積的關(guān)系曲線
2.4紫外誘變時(shí)間的確定(圖6)
圖6紫外誘變時(shí)間對致死率的影響
由圖6可知，紫外誘變270 s時(shí)，致死率達(dá)85%以上，因此，確定紫外誘變時(shí)間為270 s。
2.5菌株紫外誘變結(jié)果
菌株CF4經(jīng)過紫外誘變處理，在平皿上長出較大、厚實(shí)的單菌落共36株，其中獲得了6株產(chǎn)赤蘚糖醇菌株，命名為UV4-CF4-3、UV3-CF4-1、UV3-CF4-5、UV3-CF4-4、UV3-CF4-3、UV3-CF4-6，挑取接種到斜面上，再分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d，測定赤蘚糖醇的產(chǎn)量，結(jié)果見表1。
表1菌株CF4紫外誘變結(jié)果
由表1可以看出，菌株UV3-CF4-5赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為25.68 g·L-1，因而選擇UV3-CF4-5作為優(yōu)勢菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.6菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
將UV3-CF4-5進(jìn)行傳代培養(yǎng)，測定赤蘚糖醇的產(chǎn)量，結(jié)果見表2。
表2 UV3-CF4-5的遺傳穩(wěn)定性
由表2可知，UV3-CF4-5經(jīng)過5次傳代，赤蘚糖醇產(chǎn)量比較穩(wěn)定，說明該菌株產(chǎn)赤蘚糖醇有較好的穩(wěn)定性。
3討論
目前，赤蘚糖醇產(chǎn)生菌主要是通過耐高滲法從自然界分離，而自然界篩選出的耐高滲菌株大多數(shù)產(chǎn)甘油，單產(chǎn)赤蘚糖醇菌株較少并很難達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，這樣極大地限制了高產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的分離。
在酵母菌代謝過程中，葡萄糖通過糖酵解和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生大量的還原能，從而導(dǎo)致多種多元醇的生成。赤蘚糖醇主要是通過磷酸戊糖途徑合成的，葡萄糖通過磷酸戊糖途徑在4-磷酸赤蘚糖脫氫酶作用下生成4-磷酸赤蘚糖，4-磷酸赤蘚糖在赤蘚糖-4-磷酸激酶作用下生成赤蘚糖，然后在赤蘚糖還原酶作用下生成赤蘚糖醇。甘油是在糖酵解過程中產(chǎn)生的，葡萄糖通過糖酵解，在一系列酶的作用下生成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛氧化生成3-磷酸甘油酸的過程中產(chǎn)生甘油。本實(shí)驗(yàn)對甘油產(chǎn)生菌進(jìn)行紫外誘變，可能阻斷了糖酵解的過程，而使葡萄糖降解主要通過磷酸戊糖途徑進(jìn)行，生成赤蘚糖醇，具體阻斷機(jī)制需要進(jìn)一步研究證明。
4結(jié)論
(1)通過對產(chǎn)甘油菌株CF4進(jìn)行紫外誘變處理，獲得了6株產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株，其中菌株UV3-CF4-5產(chǎn)量最高，為25.68 g·L-1，效果比較顯著，為產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的篩選提供了一條新的途徑。
(2)研究了菌株UV3-CF4-5的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明，經(jīng)過多次傳代，菌株UV3-CF4-5產(chǎn)赤蘚糖醇的能力沒有改變，表明其是穩(wěn)定的變異株。
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