研究簡(jiǎn)介
這項(xiàng)研究聚焦于一種新型宿主靶向廣譜抗感染小分子化合物C6，該化合物屬于2-氰基-3-丙烯酰胺類DUB（去泛素化酶）抑制劑。面對(duì)全球抗生素耐藥危機(jī)和抗病毒藥物選擇有限的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)“病原體直接殺傷”策略逐漸失效，迫使科學(xué)界轉(zhuǎn)向“宿主導(dǎo)向療法”。該策略通過調(diào)控宿主自身關(guān)鍵生理過程以增強(qiáng)免疫清除能力，而非直接作用于病原體，從而有望突破耐藥性瓶頸。本研究以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）為切入點(diǎn)，首次系統(tǒng)性驗(yàn)證了DUB抑制劑在抗細(xì)胞內(nèi)病原體感染中的潛力。研究以兩種細(xì)胞內(nèi)病原體——鼠諾如病毒（MNV-1）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）為模型，前者為RNA病毒，后者為革蘭氏陽性菌，二者均能在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并逃避免疫清除。從39種結(jié)構(gòu)優(yōu)化的DUB抑制劑中篩選出化合物C6，其基于先導(dǎo)化合物WP1130和G9的核心骨架改造而成，關(guān)鍵創(chuàng)新在于通過鹵素取代和側(cè)鏈修飾顯著降低細(xì)胞毒性（RAW 264.7巨噬細(xì)胞存活率>80%），同時(shí)保留甚至增強(qiáng)抗感染活性。實(shí)驗(yàn)表明C6在5μM濃度下預(yù)處理巨噬細(xì)胞30分鐘，可使MNV-1病毒載量下降超過2個(gè)數(shù)量級(jí)（8小時(shí)），并使李斯特菌胞內(nèi)增殖減少71.7%（28.3%殘留），效果與G9相當(dāng)?shù)拘愿?。機(jī)制上C6通過抑制宿主DUB活性（如USP9x），導(dǎo)致泛素化蛋白積累，干擾病原體利用宿主泛素系統(tǒng)的策略。病毒入侵實(shí)驗(yàn)證實(shí)C6不影響MNV-1內(nèi)化，但阻斷其復(fù)制后期階段。而對(duì)李斯特菌，C6既減緩細(xì)菌內(nèi)化（內(nèi)化率從0.89降至0.35），又持續(xù)抑制胞內(nèi)增殖。
值得注意的是，C6對(duì)細(xì)菌的直接生長(zhǎng)無顯著抑制（僅輕微延遲），表明其抗感染作用主要通過宿主調(diào)控實(shí)現(xiàn)。藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，C6在小鼠肝微粒體中的代謝半衰期為20分鐘（短于G9的42分鐘），但靜脈注射后半衰期達(dá)4小時(shí)，血藥濃度顯著高于G9（7小時(shí)后54.9 ng/mL vs 4.9 ng/mL），提示其更適合靜脈給藥。這些特性使C6成為首個(gè)兼具高效抗感染活性和優(yōu)良藥物特性的DUB抑制劑候選物。本研究突破了傳統(tǒng)抗感染藥物開發(fā)的框架，首次證實(shí)通過化學(xué)干預(yù)宿主DUB可協(xié)同對(duì)抗病毒和細(xì)菌，為應(yīng)對(duì)耐藥病原體提供了“一石二鳥”的解決方案。未來研究將聚焦C6的特定靶點(diǎn)DUB鑒定、動(dòng)物模型療效驗(yàn)證及結(jié)構(gòu)進(jìn)一步優(yōu)化，推動(dòng)其向臨床轉(zhuǎn)化。這項(xiàng)成果不僅為泛素系統(tǒng)在感染免疫中的功能研究提供了工具，更為開發(fā)廣譜、低耐藥風(fēng)險(xiǎn)的抗感染藥物開辟了新路徑。
Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株104035生長(zhǎng)的毒性，將細(xì)菌培養(yǎng)至600 nm光密度(OD600)為0.5，并在含有無DUB抑制劑(未處理)或終濃度為2.5和5.0μM的化合物C6的BHI肉湯中按1:10稀釋，并在含有DMSO(載體對(duì)照)的培養(yǎng)基中稀釋，DMSO體積與所測(cè)試化合物體積相匹配。然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到100孔蜂窩板（2板），每孔300μl，一式三份，在Bioscreen C生長(zhǎng)曲線分析儀中生長(zhǎng)。平板在37℃下以中等速度連續(xù)振蕩孵育18小時(shí)，并使用Prism6軟件在線性刻度上繪圖。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
化合物C6是一種新型的2-氰基-3-丙烯酰胺類去泛素化酶（DUB）抑制劑，具有顯著的抗感染活性，能夠有效抑制兩種細(xì)胞內(nèi)病原體——鼠諾如病毒（MNV-1）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）的復(fù)制。C6在細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出低毒性，對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的存活率影響較小，優(yōu)于先前的先導(dǎo)化合物G9。C6通過抑制宿主細(xì)胞內(nèi)的DUB活性，增強(qiáng)宿主細(xì)胞的抗感染能力，而不是直接作用于病原體。C6通過抑制DUB活性，導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白的積累，從而干擾病原體的生命周期。C6在小鼠肝微粒體中的代謝半衰期約為20分鐘，靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時(shí)，顯示出良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性。C6的血藥濃度在靜脈注射后維持較高水平，優(yōu)于先導(dǎo)化合物G9，表明其具有更好的藥物潛力。
圖1、39種小分子DUB抑制劑中的兩種降低了MNV-1和單核細(xì)胞增生李斯特菌在RAW 264.7細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，效果與母體化合物G9相似。(A)用于體外感染測(cè)試39種小分子化合物對(duì)MNV-1(MNV)(左)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(右)抗感染作用的總體方案。(B和C)使用5μM化合物C6(左)和E3(右)對(duì)RAW細(xì)胞進(jìn)行MNV-1。(B)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(C)細(xì)胞培養(yǎng)感染的結(jié)果。還包括使用先前表征的化合物G9的結(jié)果。與載體(DMSO)處理的細(xì)胞水平相比，用化合物C6和E3處理導(dǎo)致病毒復(fù)制降低超過2個(gè)數(shù)量級(jí)，細(xì)菌生長(zhǎng)減少超過50%(載體處理細(xì)胞的結(jié)果與未處理細(xì)胞無顯著差異；未顯示)。使用單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett事后檢驗(yàn)比較載體處理組和化合物處理組。
圖2、化合物C6在人類細(xì)胞中抑制DUB活性并增加鼠細(xì)胞中的全局泛素化。(A)HA印跡顯示W(wǎng)P1130和化合物C6在5μM和10μM濃度下的DUB抑制作用。箭頭指示DUB活性抑制區(qū)域。(B)在鼠RAW 264.7細(xì)胞全細(xì)胞裂解物中使用抗泛素抗體(多聚和單泛素)進(jìn)行的Western blot，采用30分鐘5μM預(yù)處理(左)或30分鐘2.5μM然后1.0μM(右)處理指定時(shí)間。印跡圖代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。
圖3、單核細(xì)胞增生李斯特菌在化合物C6存在下的生長(zhǎng)曲線?；衔顲6對(duì)BHI肉湯培養(yǎng)物中單核細(xì)胞增生李斯特菌104035的體外生長(zhǎng)產(chǎn)生劑量依賴性效應(yīng)。該圖繪制了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中每種條件的三個(gè)重復(fù)樣本的平均值，誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。
圖4、化合物C6在多種處理?xiàng)l件下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響?；衔顲6的濃度和暴露時(shí)間導(dǎo)致不同水平的細(xì)胞活力。(A)測(cè)試C6對(duì)RAW細(xì)胞活力影響的三種不同策略。策略1，持續(xù)暴露；策略2，僅預(yù)處理；策略3，變化暴露(較高預(yù)處理濃度和持續(xù)較低濃度，模擬感染方案)。虛線代表RAW細(xì)胞暴露于C6的時(shí)間。(B到E)RAW 264.7細(xì)胞的刃天青細(xì)胞活力測(cè)定。上面板顯示根據(jù)策略1在8小時(shí)(B)和24小時(shí)(C)孵育后的細(xì)胞活力。下面板顯示根據(jù)策略2和3在8小時(shí)(D)和24小時(shí)(E)后的細(xì)胞活力。結(jié)果以未處理細(xì)胞在570 nm處的吸光度百分比(活力百分比)顯示。所示濃度為微摩爾。VC，載體對(duì)照。載體對(duì)照實(shí)驗(yàn)使用與C6處理組最高濃度體積相匹配的DMSO體積。
圖5、C57BL/6小鼠肝臟微粒體中化合物C6的代謝穩(wěn)定性和短期藥代動(dòng)力學(xué)研究。(A)化合物C6在小鼠肝臟微粒體中的LC-MS/MS分析。代謝半衰期為20.12分鐘。(B)口服和靜脈注射化合物C6的短期藥代動(dòng)力學(xué)分析(每種情況2只小鼠)。在給藥后0.5、2、4和7小時(shí)測(cè)量血液中的濃度?？诜┝繛?0毫克/千克，靜脈注射劑量為10毫克/千克。
總結(jié)
抗生素耐藥性的上升和有效抗病毒藥物數(shù)量的稀少，迫切需要治療傳染病的新方法。識(shí)別基于宿主的治療靶點(diǎn)代表了藥物發(fā)現(xiàn)的新興策略。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的核心模式，可能是增強(qiáng)宿主控制感染能力的治療的有前景靶點(diǎn)。去泛素化酶(DUB)是宿主炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，之前的研究已證明一種選擇性DUB抑制劑及其衍生物在宿主細(xì)胞中促進(jìn)抗感染活性。
為了尋找具有抗感染功效但改善毒性特征的化合物，本研究測(cè)試了一個(gè)主要由2-氰基-3-丙烯酰胺小分子DUB抑制劑組成的化合物庫(kù)在巨噬細(xì)胞中對(duì)兩種細(xì)胞內(nèi)病原體。鼠諾如病毒(MNV)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的抗感染活性。鑒定出化合物C6，它抑制人和鼠細(xì)胞中的DUB活性，并在細(xì)胞培養(yǎng)中毒性最小的情況下減少兩種病原體的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用C6處理并未顯著影響巨噬細(xì)胞內(nèi)化病毒的能力，這表明抗感染活性干擾了MNV生命周期中進(jìn)入后的階段。
代謝穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定顯示，C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，當(dāng)靜脈注射給藥時(shí)在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時(shí)。本研究結(jié)果為在開發(fā)針對(duì)傳染病的基于宿主的療法中靶向宿主泛素系統(tǒng)提供了框架。化合物C6代表了一種有前景的工具，可用于闡明DUB在巨噬細(xì)胞應(yīng)對(duì)感染反應(yīng)中的作用。C6的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型宿主導(dǎo)向療法（HDT）提供了有力的候選化合物，這種療法通過增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)來對(duì)抗多種病原體，而不是直接靶向病原體，從而降低了耐藥性發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。
Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀主要用于評(píng)估化合物C6對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）的直接抗菌活性，Bioscreen C的測(cè)試的生長(zhǎng)曲線為研究團(tuán)隊(duì)提供了關(guān)鍵證據(jù)，證明C6的抗感染活性主要依賴于宿主細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，而非直接作用于病原體。這支持了宿主導(dǎo)向療法（HDT）的合理性，即通過增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)來對(duì)抗多種病原體。未來的研究將集中在進(jìn)一步探索C6的具體作用機(jī)制，包括鑒定其抑制的特定DUB酶及其下游靶點(diǎn)，以及在動(dòng)物模型中驗(yàn)證C6的抗感染效果和安全性。C6作為一種新型DUB抑制劑，不僅在體外顯示出良好的抗感染活性和低毒性，還具有優(yōu)化的藥代動(dòng)力學(xué)特性，為開發(fā)新型抗感染藥物提供了重要的基礎(chǔ)。
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