2.4病毒拯救
收獲轉(zhuǎn)染后的病毒接種至新的BHK-21細胞，48 h后反復凍融細胞，收獲F1代病毒。將F1代病毒連續(xù)盲傳至F3代，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。結果（圖4）顯示，出現(xiàn)典型的CPE，細胞收縮變圓，有的開始脫落，而對照細胞無變化。將拯救病毒命名為rSVA。
圖4病毒拯救顯微鏡觀察結果
2.5拯救病毒鑒定
F5代rSVA分節(jié)段PCR擴增結果（圖5）顯示，成功擴增出預期大小的SVA全基因組序列的7個片段。經(jīng)測序鑒定，測序結果與親本毒株高度同源。
圖5拯救病毒分節(jié)段PCR鑒定結果
2.6生長曲線分析
為比較拯救病毒與親本病毒的復制能力與增殖特性，繪制病毒生長曲線（圖6），發(fā)現(xiàn)兩種病毒的復制能力與增殖特性相似，無明顯差異。
圖6 rSVA與親本病毒生長曲線
2.7間接免疫熒光試驗
對親本病毒與拯救病毒進行間接免疫熒光試驗。結果（圖7）顯示：感染BHK-21細胞18 h后，親本病毒與拯救病毒在熒光顯微鏡下均能顯示出特異性的綠色熒光，而對照細胞沒有綠色熒光產(chǎn)生。
圖7間接免疫熒光試驗結果
2.8噬斑形成試驗
接種至BHK-21細胞后，rSVA與親本病毒均能產(chǎn)生明顯的噬斑（圖8），且噬斑大小及形態(tài)基本一致，表明拯救病毒與親本病毒具有相似的噬斑形成能力。
圖8噬斑試驗結果
3討論
SVA最初從被污染的PER.C6細胞系中分離得到。污染物被認為源自胎牛血清或豬胰蛋白酶，早期作為溶瘤病毒而受到關注。2015年SVA在廣東省某豬場首次被發(fā)現(xiàn)并報道，隨后逐漸蔓延至我國多個省份。SVA可引起與FMD等水泡病類似的臨床癥狀并造成巨大經(jīng)濟損失。據(jù)報道，近年來SVA在我國流行分布較廣泛，其診斷目前主要依賴于病原學及血清學檢測，在防控方面尚未開發(fā)出商業(yè)化疫苗。
反向遺傳操作技術在反轉(zhuǎn)錄病毒的分子特性研究中是一項重要工具，為RNA病毒在遺傳特性、疫苗構建等方面奠定了重要基礎。為快速構建SVA感染性克隆平臺，本試驗采用快速一步法，即將SVA全長基因組序列一次擴增，并與設計的CMV啟動子、poly（A）+HDVr基因相連接，同時基因上的同源臂保證3段基因能夠依次插入線性化的低拷貝質(zhì)粒中。在同源重組酶催化下，37℃反應30 min即可一步完成同源重組結合，實現(xiàn)體外環(huán)化，將構建好的重組質(zhì)粒pWSK-29-SVA直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR鑒定，質(zhì)粒構建正確。
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后，第1代病變不明顯，在盲傳3代后可出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細胞圓縮、脫落，初步表明病毒拯救成功。本研究在盲傳至第5代時進行病毒拯救鑒定，此時能夠降低感染性克隆質(zhì)粒干擾，同時使用含有去除DNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒可以清除殘存質(zhì)粒。通過RT-PCR方法分7段擴增病毒基因，并分別對擴增子進行正反兩向測序，發(fā)現(xiàn)測序結果與親本毒株一致。為研究拯救毒株與親本毒株生物學特性的差異，本試驗比較了F5 rSVA與親本第5代SVA的生長動力曲線，結果表明拯救毒株與親本毒株生長動力曲線基本一致。噬斑形成試驗顯示，拯救毒株與親本毒株產(chǎn)生噬斑大小、形狀基本一致，表明一步法構建SVA感染性克隆平臺準確有效。
病毒感染性克隆的關鍵在于全長cDNA構建，SVA基因組長度較短（約7.3 kb），為單股正鏈RNA。本研究在構建感染性克隆過程中使用高保真DNA聚合酶，這樣能夠高效擴增基因組，并且可有效避免出現(xiàn)突變。但當片段長度大于5 kb時聚合酶的錯誤率呈指數(shù)級上升，因此對于較長的基因組，若擔心長片段擴增導致保真度降低，可將病毒基因組分成多節(jié)段進行擴增，同時設計好同源臂并確保連接正確，這樣也可實現(xiàn)快速質(zhì)粒構建。
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