1.5 TCGA數(shù)據(jù)庫分析
分析TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱癌的生存數(shù)據(jù)和目的基因的預(yù)后相關(guān)性。
1.6慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
為構(gòu)建穩(wěn)定敲低表達(dá)CLDN10的膀胱癌細(xì)胞株，將含sh-CLDN10的慢病毒質(zhì)粒(Lipofectamine3000，Invotrigen，美國)感染293-T細(xì)胞，72 h后收集病毒液。然后將病毒液感染膀胱癌T24細(xì)胞，48 h后在顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)情況。確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后將T24細(xì)胞用胰酶消化，分裝凍存。將敲低表達(dá)CLDN10膀胱癌T24細(xì)胞作為敲低CLDN10組，以未轉(zhuǎn)染的膀胱癌T24細(xì)胞作為對(duì)照組。
1.7 CCK-8檢測(cè)
用Bioscreen C 公司全自動(dòng)生長曲線分析儀檢測(cè)細(xì)胞生長情況。96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長到80%~90%時(shí)，按預(yù)先設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞的生長值，在時(shí)間點(diǎn)之前30~120 min每孔加入20μL CCK-8試劑(100μL培養(yǎng)基加入10μL試劑)，繼續(xù)培養(yǎng)。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)量各孔光密度值，然后根據(jù)所測(cè)值計(jì)算并繪制生長曲線。
1.8細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)
接種細(xì)胞到6孔板，每孔接種約500個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)5~7 d后肉眼可見克隆時(shí)，甲醇固定30 min、結(jié)晶紫液染色30 min后，在鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析和處理數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1免疫組化檢測(cè)膀胱癌組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況
免疫組化結(jié)果表明，除CD3、CD8外，巨噬細(xì)胞表面特征性CD68分子在癌細(xì)胞周圍的間質(zhì)中染色呈強(qiáng)陽性，而CD68在癌旁正常組織中的染色呈陰性(圖1)。
A：膀胱癌組織；B：癌旁組織
圖1膀胱癌組織及癌旁組織中免疫細(xì)胞表面特征性分子的表達(dá)
2.2免疫組化檢測(cè)膀胱癌組織中巨噬細(xì)胞的浸潤情況
免疫組化結(jié)果表明，M2巨噬細(xì)胞表面特征性分子CD163在膀胱癌組織中表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而M1巨噬細(xì)胞表面特征性分子iNOS則表達(dá)陰性(圖2A)；iNOS和CD163分子在癌旁正常組織表達(dá)陰性(圖2B)。
A：膀胱癌組織；B：癌旁組織
圖2巨噬細(xì)胞表面特征性分子在膀胱癌組織的表達(dá)
2.3膀胱癌及癌旁組織全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果
對(duì)10對(duì)膀胱癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明，癌組織和癌旁組織間有4 640個(gè)差異表達(dá)基因(Fold change>2，F(xiàn)DR<0.05，圖3A)。采用軟件分析篩選出膀胱癌組織中巨噬細(xì)胞浸潤高低兩組間的差異表達(dá)基因(圖3B)。將A、B兩組基因進(jìn)行交叉性分析，篩選出兩者間共同調(diào)控的表達(dá)基因，其中CLDN10基因表達(dá)明顯升高，最為顯著(圖3C)。
A：癌組織和癌旁組織間的基因表達(dá)差異；B：巨噬細(xì)胞浸潤評(píng)分高低兩組間的基因表達(dá)差異；C：軟件分析篩選出A、B兩組間的共同差異表達(dá)基因
圖3兩組間基因表達(dá)差異熱圖
2.4免疫組化檢測(cè)CLDN10在膀胱癌組織的表達(dá)部位
為明確CLDN10在膀胱癌組織的表達(dá)部位，選取膀胱癌組織石蠟切片進(jìn)行IHC實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，CLDN10表達(dá)于膀胱癌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜部位(圖4)。
圖4免疫組化檢測(cè)CLDN10在膀胱癌組織的表達(dá)
2.5 Western blot檢測(cè)CLDN10在膀胱癌組織中的表達(dá)
提取10對(duì)膀胱癌組織的蛋白液后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，CLDN10蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)升高，而在癌旁組織中表達(dá)相對(duì)較低(P<0.05，圖5)。
A：Western blot檢測(cè)結(jié)果T：膀胱癌組織；N：癌旁組織；1~10：為標(biāo)本序號(hào)；B：蛋白半定量分析a：P<0.05，與癌組織比較
圖5 Western blot檢測(cè)CLDN10在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá)
2.6 CLDN10促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生長和增殖
為探討CLDN10在膀胱癌細(xì)胞生長和增殖中的作用情況，首先用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)CLDN10的膀胱癌T24細(xì)胞株(圖6A)。然后用CCK-8試劑檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的生長能力，平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，敲低CLDN10組膀胱癌細(xì)胞的生長能力明顯減弱(圖6B)，細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少(198.0±10.3 vs 145.0±8.4，P<0.05，圖6C)。
A：Western blot驗(yàn)證穩(wěn)定敲低CLDN10的膀胱癌T24細(xì)胞株；B：CCK-8檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的生長曲線；C：平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的克隆形成能力(n=3)
圖6檢測(cè)敲低CLDN10表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞的生長和增殖能力變化
2.7 TCGA數(shù)據(jù)庫中CLDN10與膀胱癌患者的預(yù)后分析
利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CLDN10與膀胱癌患者的預(yù)后，結(jié)果顯示CLDN10高表達(dá)的患者預(yù)后較差(圖7)。
圖7 TCGA數(shù)據(jù)庫中CLDN10與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系
2.8敲低CLDN10后膀胱癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)
為檢測(cè)敲低CLDN10對(duì)膀胱癌細(xì)胞EMT的影響，用Western blot檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞中部分EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，敲低膀胱癌T24細(xì)胞CLDN10的表達(dá)后，Snail1、Vimentin、Twist蛋白表達(dá)水平下降，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高(圖8)。
a：P<0.05，與對(duì)照組比較
圖8 Western blot檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞內(nèi)部分EMT指標(biāo)蛋白表達(dá)水平
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