2結(jié)果
2.1苯酚降解菌的馴化、篩選與分離
篩選出4株能以苯酚為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，且對(duì)苯酚的耐受濃度均能達(dá)到1 500mg/L，分別命名為Y_1、Y_2、Y_3和Y_4。將4株菌在同一條件下培養(yǎng)：苯酚濃度800 mg/L、pH 7.2、接種量4%、溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)30 h取樣測(cè)定培養(yǎng)基苯酚濃度。4株菌對(duì)苯酚的降解情況見(jiàn)圖1。由此可見(jiàn)，菌株Y_1的生長(zhǎng)情況和降酚能力優(yōu)于其他菌株。
圖1 4株菌降酚情況
2.2菌株的初步鑒定
2.2.1形態(tài)學(xué)觀(guān)察
如圖2所示，菌株Y_1形成的菌落呈圓形，不透明，表面隆起、濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，顏色為乳白色，不可在平板上滑動(dòng)。菌株革蘭氏染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞呈桿狀，有莢膜，有芽孢，有鞭毛。
圖2在平板上的生長(zhǎng)情況
2.2.2生理生化鑒定
對(duì)菌株Y_1進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，結(jié)果見(jiàn)下表。菌株可以分解葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，V-P反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，甲基紅和吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。對(duì)比《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[35]關(guān)于細(xì)菌的描述，菌株Y_1生理生化鑒定的結(jié)果基本符合芽孢桿菌的特征，再結(jié)合其形態(tài)學(xué)觀(guān)察的結(jié)果，可以初步將該菌株確定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。
表菌株Y_1的生理生化特征
2.3 16S rDNA分析
2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
以菌株Y_1基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到一條約為1.5 Kb的DNA片段。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，在約1 500 bp處有一清晰的條帶，符合預(yù)期結(jié)果。
圖3電泳檢測(cè)結(jié)果
2.3.2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
測(cè)序后發(fā)現(xiàn)菌株Y_1的核苷酸序列共有1434 bp，符合預(yù)期。通過(guò)同源性比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)，菌株Y_1與芽孢桿菌屬相似度最高，選擇了在種屬水平最接近的19株菌，通過(guò)MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4所示。由圖可知，菌株Y_1與蠟樣芽孢桿菌(登錄號(hào)：CP011153.1)的同源性高達(dá)99%，與蘇云金芽孢桿菌(登錄號(hào)：CP021061.1、CP015250.1、CP015176.1、CM000747.1、017208.1)也具有99%的同源性。結(jié)合其形態(tài)學(xué)觀(guān)察和生理生化鑒定的結(jié)果，可以將菌株Y_1確認(rèn)為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。
2.4生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定
對(duì)菌株Y_1的生長(zhǎng)情況做了測(cè)定，由圖5可知，當(dāng)菌株培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在20h以后處于穩(wěn)定生長(zhǎng)階段。在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h，當(dāng)OD≈0.8時(shí)，菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期，離心分離菌體制成種子液，用于后續(xù)苯酚降解實(shí)驗(yàn)。
圖5菌株Y_1生長(zhǎng)曲線(xiàn)
2.5菌株的降酚特性
2.5.1苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
以苯酚濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度(λ=510)為縱坐標(biāo)，繪制苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如圖6所示。該苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表明，當(dāng)波長(zhǎng)等于510 nm時(shí)，苯酚濃度范圍在2～20 mg/L之間，吸光度值Y和苯酚濃度X，滿(mǎn)足線(xiàn)性方程Y=0.1456X+0.0089，R2=0.9996，表明二者呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。
圖6苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
2.5.2苯酚降解曲線(xiàn)
每6個(gè)小時(shí)取樣培養(yǎng)液，測(cè)定剩余的苯酚濃度。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，剩余苯酚濃度為縱坐標(biāo)，繪制苯酚降解曲線(xiàn)。如圖7所示，結(jié)果表明：培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，苯酚濃度越低，降解率隨之升高。培養(yǎng)到42h時(shí)，剩余苯酚濃度為104mg/L，苯酚降解率高達(dá)90.5%，說(shuō)明菌株Y_1具有較強(qiáng)的降酚能力，達(dá)到高效降酚菌的標(biāo)準(zhǔn)。
圖7苯酚降解曲線(xiàn)
3結(jié)論
3.1從綿陽(yáng)某絕緣材料廠(chǎng)的活性污泥中分離得到4株苯酚降解菌。其中菌株Y_1的降酚能力最強(qiáng)，經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定，初步確定該菌為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。
3.2生理生化特性表明，當(dāng)溫度在15～40℃、pH值在4.4～10.0以及NaCl濃度在2%～10%時(shí)該菌均能良好生長(zhǎng)。
3.3降酚特性研究表明，當(dāng)苯酚初始濃度為1 100 mg/L時(shí)，在36 h內(nèi)，菌株Y_1對(duì)苯酚的降解率達(dá)到了90%，屬于高效降酚菌。
本文分離篩選出一株能高效降解苯酚的菌株Y_1，能在以苯酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)與降酚同步進(jìn)行。該菌屬主要在害蟲(chóng)防治中發(fā)揮作用，用于降解苯酚的蘇云金芽孢桿菌鮮見(jiàn)報(bào)道。菌株Y_1降解苯酚的能力較強(qiáng)，且能很好地適應(yīng)環(huán)境，是一株理想的苯酚降解出發(fā)菌株，具有重要的研究?jī)r(jià)值。
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