2結(jié)果
2.1顯微鏡觀察結(jié)果
DHV-1 ZJ-08株在DEF-h細(xì)胞中培養(yǎng)24 h后，可以觀察到CPE，72 h更明顯，主要表現(xiàn)為細(xì)胞間隙增寬、拉網(wǎng)、脫落、細(xì)胞崩解和死亡等特征，而對照細(xì)胞的形態(tài)則表現(xiàn)良好的生長形態(tài)(圖1)。
2.2 RT-PCR檢測結(jié)果
采用RT-PCR方法檢測經(jīng)DEF-h細(xì)胞培養(yǎng)的第3代DHV-1的基因組。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得一條長約471 bp的特異性基因片段。該P(yáng)CR產(chǎn)物的序列測定結(jié)果表明該序列與DHV ZJ-08株的基因序列同源性在99%以上。
2.3 IFA檢測結(jié)果
DHV-1在DEF-h細(xì)胞中培養(yǎng)48 h后，經(jīng)IFA檢測結(jié)果顯示，有大量特異性綠色熒光(圖2)，表明DHV-1病毒蛋白獲得了良好表達(dá)。
2.4 Western blot檢測結(jié)果
采用western blot對感染DHV-1的DEF-h細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)檢測，結(jié)果顯示，在DEF-h細(xì)胞裂解物中能夠檢測到DHV-1 VP1的存在(分子量約26 ku)，而且能夠與抗VP1的抗體特異性反應(yīng)(圖3)，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。
圖1 DHV-1病毒感染的DEF-h細(xì)胞(A-C)與正常DEF-h細(xì)胞(D)(400×)
圖2 IFA檢測DHV-1 VP1在DEF-h細(xì)胞中的表達(dá)(400×)
2.5雞胚感染試驗結(jié)果
將在DEF-h細(xì)胞中培養(yǎng)3代的DHV-1接種9日齡雞胚，觀察6 d。結(jié)果表明DEF-h細(xì)胞中增殖的DHV-1能夠致死雞胚(48 h～96 h)，死亡率為80%(12/15)，而用雞胚分離的第5代病毒對雞胚的致死率僅為40%，提示DHV-1更容易適應(yīng)DEF-h細(xì)胞。
2.6 DHV-1在DEF細(xì)胞中的增殖規(guī)律
一步生長曲線表明DHV-1在DEF-h細(xì)胞中的增殖規(guī)律為：DHV-1感染DEF-h細(xì)胞后12 h開始增殖，36 h～72 h進(jìn)入一個快速增殖期，84 h病毒滴度達(dá)到峰值，病毒滴度為4.54 TCID50/mL。96 h后，病毒的增殖隨著細(xì)胞的崩潰而降低(圖4)。
圖3 Western blot檢測DHV-1 VP1
圖4 DHV-1在DEF-h細(xì)胞中的增殖規(guī)律
3討論
目前，DHV的分離方法為采用SPF雞胚或鴨胚分離，該方法雖然有效，但國內(nèi)外研究均表明，DHV-1野毒株通常不易適應(yīng)在鴨胚或雞胚的增殖，往往需要盲傳3代以上才能分離到病毒。因此，用禽胚直接分離DHV比較費(fèi)時，而且SPF鴨胚的來源也十分有限，不能隨時獲得，使得用鴨胚分離DHV-1的方法受到很大限制。為此，本實驗室構(gòu)建了一種永生化的DEF-h細(xì)胞系，該細(xì)胞系對DHV-1十分敏感，為開展DHV-1的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了良好的平臺。
本研究在建立DEF細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，研究DHV-1在DEF-h細(xì)胞系中的增殖特性，為進(jìn)一步研究DHV-1的致病機(jī)理和病毒與宿主之間的相互作用等奠定基礎(chǔ)。本研究表明，DHV-1野毒(ZJ-08株)第一代就可以適應(yīng)DEF-h細(xì)胞，而且產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變(48 h)，72 h病毒滴度為4.3 TCID50/mL。在DEF-h細(xì)胞中連續(xù)增殖3代的DHV-1對雞胚具有較強(qiáng)的致病性，致死率高于用雞胚傳代5次的DHV-1。表明用DEF-h細(xì)胞系分離DHV-1不僅比使用雞胚或鴨胚分離病毒更便捷、易行，而且為開展DHV-1分子生物學(xué)研究提供良好的操作平臺。
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