2.2優(yōu)良菌株的生物學(xué)特性
2.2.1菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況
將篩選得到的4株菌進(jìn)行培養(yǎng)，分析生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)曲線如圖1-a所示，乳酸菌A1、C7和葡萄球菌S6、S7表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)趨勢(shì)，0～2 h內(nèi)為延滯期，從2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在10 h后進(jìn)入生長(zhǎng)平穩(wěn)期，這表明篩選得到的乳酸菌和葡萄球菌具備良好的生長(zhǎng)特性。快速產(chǎn)酸是衡量乳酸菌發(fā)酵劑品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。產(chǎn)酸速率快可縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期，并使乳酸菌迅速成為優(yōu)勢(shì)菌群，抑制有害菌及致病菌的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品的生物安全性。由圖1-b可知，2株乳酸菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，24 h內(nèi)pH值由5.7下降至3.6，主要是對(duì)數(shù)期產(chǎn)酸較多。pH值迅速降低有利于抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，保證肉制品品質(zhì)。從生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸速度2方面考慮，可以將乳酸菌A1和C7作為鲊肉粉的發(fā)酵菌種。
a-生長(zhǎng)曲線；b-產(chǎn)酸能力圖1菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力
2.2.2葡萄球菌耐酸性測(cè)定
在發(fā)酵肉制品中，通常需要將乳酸菌與葡萄球菌進(jìn)行復(fù)配，制成復(fù)合發(fā)酵劑。因此，篩選的葡萄球菌應(yīng)具有一定的耐酸性能，適應(yīng)低pH值。葡萄球菌在不同酸性條件的生長(zhǎng)情況如圖2所示。
圖2不同pH值下菌株的吸光度
隨著pH值由4增加到9，2株葡萄球菌的生長(zhǎng)能力均呈現(xiàn)先增加后下降，在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，其OD600值均達(dá)到1.5以上，在pH值4～5，2株葡萄球菌能較好生長(zhǎng)，說明其能適應(yīng)偏酸性的發(fā)酵環(huán)境，具有作為鲊肉粉發(fā)酵劑的潛力。
2.2.3菌株耐食鹽性測(cè)定
發(fā)酵肉制品中含鹽量較高，添加量一般為6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。食鹽可以防腐、增強(qiáng)肉的保水力，同時(shí)也會(huì)對(duì)發(fā)酵菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，因此需要測(cè)試篩選菌株的耐鹽性。從圖3中可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，菌株受到了不同程度的影響，生長(zhǎng)力下降。乳酸菌A1和C7在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)生長(zhǎng)良好，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)吸光值在0.1左右，生長(zhǎng)受到抑制。葡萄球菌S6和S7在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)也能良好的生長(zhǎng)，說明葡萄球菌S6和S7具有較強(qiáng)的耐鹽性。鲊肉粉中的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，因此，4株菌株都可以作為鲊肉粉的發(fā)酵菌株。
圖3不同鹽含量下菌株的吸光度
2.2.4菌株耐亞硝酸鹽性測(cè)定
亞硝酸鹽可以改善發(fā)酵肉制品的色澤，一般要求用來生產(chǎn)肉品發(fā)酵劑的微生物可耐100 mg/kg NaNO2。從圖4可以看出，隨著NaNO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，對(duì)乳酸菌A1和C7的生長(zhǎng)抑制逐漸增強(qiáng)。在100 mg/kg時(shí)，菌株尚可良好生長(zhǎng)，當(dāng)NaNO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150 mg/kg時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制。在0～50 mg/kg時(shí)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，對(duì)葡萄球菌S6和S7的抑制顯著增加，在50～150 mg/kg時(shí)，菌株的生長(zhǎng)抑制變化小，這與劉夏煒的研究結(jié)果一致。由此可知，4株菌株都可以作為鲊肉粉發(fā)酵菌株。
圖4不同亞硝酸鹽添加量下菌株的吸光度
2.3菌株鑒定
2.3.1形態(tài)學(xué)特征
篩選菌株的菌落形態(tài)見表2，通過革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果如圖5所示，乳酸菌A1、C7呈桿狀，葡萄球菌S6、S7呈串狀。
表2四株菌的形態(tài)學(xué)特征
圖5菌株A1、C7、S6、S7革蘭氏染色顯微形態(tài)
2.3.2菌株的16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
菌株的PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析結(jié)果如圖6所示，擴(kuò)增出約1 500 bp的DNA片段，條帶清晰，無雜帶。用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如圖7所示。A1、C7與GenBank中植物乳桿菌的16S rDNA序列相似性達(dá)99%以上，可初步確認(rèn)為植物乳桿菌。
M-Marker；Y-陰性對(duì)照；1-A1；2-C7；3-S6；4-S7圖6提取DNA模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)圖譜
a-植物乳桿菌A1、C7;b-沃氏葡萄球菌S6;c-巴氏葡萄球菌S7圖7基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹
菌株S6、S7的16S rRNA分別與GenBank中沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的16S rDNA序列相似性達(dá)99%以上，可初步確認(rèn)S6為沃氏葡萄球菌，S7為巴氏葡萄球菌。
3結(jié)論
本研究從自然發(fā)酵鲊肉粉中篩選出4株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，通過16S rDNA序列分析可知，2株乳酸菌均為植物乳桿菌，2株葡萄球菌分別是沃氏葡萄球菌和巴氏葡萄球菌。植物乳桿菌A1、C7產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快，葡萄球菌S6、S7耐酸且能產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，4株菌對(duì)食鹽和亞硝酸鹽均具有較好的耐受性，研究結(jié)果為鲊肉粉接種發(fā)酵提供理論支撐。后期工作將篩選得到的菌株接種到鲊肉粉中，進(jìn)行鲊肉粉的混菌發(fā)酵的進(jìn)一步研究。
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