圖2、Rif對一類新型超敏突變體的殺菌作用。a，rpoB突變體對Rif的敏感性和抗性圖譜。b，a中數(shù)據(jù)的火山圖。終止密碼子為灰色。c，超敏突變體中Rif的MIC（P=1.2×10?4，從左到右為2.1×10?3）。d，用80μg ml-1 Rif處理1小時后恢復1小時后，來自野生型（WT）和rpoB T525D RNAP在高度轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）周圍ChIP-seq信號的薈萃分析。e，80μg ml-1 Rif處理1小時后超敏突變體的接種效率（n=6;P=5.7×10?4、1.8×10?4）。f，用80μg ml-1 Rif處理1小時后，通過TUNEL染色測量超敏突變體的DNA損傷。TUNEL陽性細胞是在超過99%的未處理細胞中檢測到的超過信號的細胞百分比（n=4;P=1.3×10?2、4.7×10?3）。g，80μg ml-1 Rif處理1小時后recA或recBCD敲除菌株中超敏突變體的接種效率（n=4，P=5.3×10-2,7.3×10-3,4.2×10-5,5.7×10-5）。h，用80μg ml-1 Rif處理1小時后，使用SLR-qPCR測量的啟動子和基因體上每10千克堿基（kb）的DSB數(shù)（P=2.4×10-3、1.7×10-5、1.2×10-4、3.7×10-3、2.4×10-5、4.2×10-5）。i，超敏突變體在含有復制蛋白dnaC的溫度敏感等位基因的PC2背景中的接種效率（P=1.8×10-3、7.6×10-5）。通過將細胞移至42°C 1.5小時，然后用80μg ml-1 Rif處理30分鐘來阻斷復制。
圖3、利福平結合位點突變體的生長特性及與平均位置特性的進化保守性比較。a,在25°C下生長的5-氟尿嘧啶敏感突變體的生長曲線。b,按5-氟尿嘧啶敏感性分層的rpoB突變體在25°C和42°C下的生長曲線。c,在25°C下生長的野生型細胞添加亞抑制濃度的雙環(huán)霉素的生長曲線。除非另有說明，生長曲線代表n=3個生物學獨立實驗的平均值，誤差條表示95%置信區(qū)間。
圖4、使用Bioscreen全自動生長曲線分析儀對利福平超敏感突變體（hypersensitive mutants）在80μg/mL利福平處理1小時后的恢復情況進行了生長曲線分析。測量了這些突變體在經(jīng)過利福平處理后的生長恢復情況，以評估其對藥物的敏感性。
圖5、rpoB 515Y突變體與野生型細胞在添加0、0.1或1μg/mL胸腺嘧啶（thymidine）條件下的生長曲線。數(shù)值代表2個生物學重復的平均值。
總結
本研究是關于抗生素結合位點的高分辨率研究，特別是針對利福平（Rifampicin，Rif）與大腸桿菌（Escherichia coli）RNA聚合酶（RNAP）結合位點的詳細遺傳學分析。研究團隊通過多路復用基因組工程技術，生成并表征了涵蓋大腸桿菌RNA聚合酶整個利福平結合位點的760個單氨基酸突變體。這些突變體覆蓋了rpoB基因的510-537和563-572位置，這些位置與利福平的結合有關。
研究者使用MAGE技術結合測序，不受正向選擇和低突變率的限制，能夠以極高的效率和特異性引入和監(jiān)測細菌染色體上感興趣區(qū)域的突變。通過這種方法，研究者生成了涵蓋利福平結合位點每個位置所有可能替代的RNAP突變體集合，并提供了利福平結合相互作用的詳細遺傳圖譜。
Bioscreen C全自動生長曲線分析儀用于監(jiān)測不同突變體在利福平（Rifampicin）處理下的生長恢復情況。通過設置不同的時間點和處理條件，研究者能夠詳細觀察突變體在藥物處理后的生長延遲和恢復情況。Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在本研究中提供了高通量、自動化和精確的生長曲線監(jiān)測功能，極大地提高了實驗效率和數(shù)據(jù)的可靠性，為研究利福平結合位點的突變體提供了重要的技術支持。本研究成果提供了對利福平結合位點的深入理解，揭示了RNAP的突變?nèi)绾斡绊懣股氐慕Y合和細菌的生理反應，為開發(fā)新的抗生素和理解細菌耐藥性提供了重要的科學依據(jù)。
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