1.2試驗方法
1.2.1突變株及回補菌株的獲得參考青枯雷爾氏菌GMI1000hrcN基因設(shè)計引物hrcN-F（5′-GGCTGAT ATCGGATCCATGACCCATCTCGCGCTG-3′）和hrcN-R（5′-GGTGGTGGTGCTCGATCATGCCAGTGCG ATCTCGTC-3′）。提取CBM613菌株DNA，PCR擴增。將回收的DNA片段連接到T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取PCR驗證過的陽性克隆菌株測序。利用Krogh等的方法預(yù)測分子量、PI、跨膜區(qū)域和親水性；利用深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)SignalP 5.0預(yù)測信號肽；利用clustalw在線比對hrcN的基因和蛋白質(zhì)序列；Motif預(yù)測蛋白功能采用Nicolas等的方法；在線預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位。
根據(jù)hrcN基因及上下游序列、慶大霉素（Gm）抗性基因序列設(shè)計引物（表1），首先擴增出hrcN基因上、下游同源重組臂序列，從pJQ200SK質(zhì)粒上擴增Gm抗性基因編碼序列；然后利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段（hrcN基因上游-Gm-hrcN基因下游），經(jīng)SmaI酶切完成打靶載體pCVD442-ΔhrcN::Gm的構(gòu)建；最后通過同源重組和電轉(zhuǎn)化大腸桿菌，與受菌體（CBM613菌株）結(jié)合，在含Gm的NB培養(yǎng)基上篩選突變株，并用表1中的鑒定引物鑒定突變株。
表1 hrcN基因敲除所需引物
通過hrcN-1F/hrcN-1R擴增出hrcN片段，經(jīng)XbaI/EcoR I酶切后克隆入pRK415質(zhì)粒對應(yīng)的酶切位點，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞后，鋪四環(huán)素（Tc）平板篩選陽性克隆，完成pRK415-hrcN基因回補質(zhì)粒構(gòu)建?；匮a質(zhì)粒pRK415-hrcN電轉(zhuǎn)化大腸桿菌，與受體菌（CBM613/ΔhrcN）結(jié)合，在含Tc的TSB培養(yǎng)基上篩選回補菌株，用pRK415-F/pRK415-R引物進行PCR鑒定回補菌株。
1.2.2表型測定
番茄感病品種為中蔬5號，按照He等根部接種法接種菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補菌株各接種15株，3次重復(fù)。按照Meng等的方法計算青枯病的病情指數(shù)；分別挑取3種菌株于NB培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min搖床培養(yǎng)獲得菌懸液，10000 r/min離心5 min收集菌體。按照Kanda等方法測定600 nm的吸光度值，計算生長曲線；取濃度為3×108CFU/mL的野生型菌株、突變株和回補菌株菌液各5μL，3種菌株的泳動性檢測按照Kelman等方法測量菌落直徑。3種菌株的生物被膜的測定參考Meng等的方法測定490 nm的吸光度值。
2結(jié)果與分析
2.1 hrcN基因的擴增結(jié)果
PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳，圖1結(jié)果顯示，條帶清晰而且特異，大小1300 bp左右。將該條帶回收，然后連接到T載體并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到的陽性克隆進行菌落PCR鑒定并測序，測序發(fā)現(xiàn)基因長度為1320 bp，共編碼439個氨基酸，結(jié)果表明已擴增出番茄青枯雷爾氏菌CBM613的hrcN基因，DNA序列已提交到GenBank（Gene ID：No.42594317）。預(yù)測HrcN蛋白分子量為47.54 kD，PI為4.97，無信號肽（預(yù)測有信號肽概率為1.734%），無跨膜區(qū)域，整體呈弱親水性（圖2）。Motif預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白為ATP酶，蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測其定位于細(xì)胞內(nèi)膜和細(xì)胞質(zhì)。
圖1菌株CBM613 hrcN基因的擴增
圖2菌株CBM613 HrcN蛋白親水性預(yù)測
通過與菌株GMI1000的hrcN基因序列進行在線比對發(fā)現(xiàn)，該基因一致性為99.6%，在青枯雷爾氏菌中非常保守。青枯雷爾氏菌與參比菌株GMI1000hrcN基因相比共有5個SNP位點，具體突變信息為216：A-G GTA-GTG val；609：T-C CGT-CGC arg；879：T-C CGT-CGC arg；907：G-A GCC-ACC ala-thr；999：T-C GGT-GGC gly。只有907位氨基酸發(fā)生改變（由GMI1000的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸），其他5個SNP都是無意突變。
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