1.2.4實時定量PCR
收集對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，鋪板密度為1.0×105個細胞/孔，接種于六孔培養(yǎng)板內，設置空白對照組、陽性對照組（濃度為1μg·mL?1的LPS）、人參外泌體給藥組（5、10、20μg·mL?1），培養(yǎng)24 h，棄去原有培養(yǎng)基，按照分組給藥，培養(yǎng)24 h后收集細胞，用Trizol提取總mRNA，根據(jù)反轉錄試劑盒說明合成cDNA。使用實時定量PCR檢測IL-6、iNOS、TNF-α、MCP-1轉錄水平的含量。實時定量PCR擴增反應條件是94℃，30 min，1個循環(huán)；94℃，30 s，55℃，30 s，40個循環(huán)；95℃，1 min，72℃，10 min，1個循環(huán)，PCR引物序列如表1。
表1實時定量PCR引物序列
以GAPDH為內參，根據(jù)2?ΔΔCt的方法確定轉錄水平變化。
1.2.5流式細胞術檢測人參外泌體對RAW264.7細胞極化的影響
RAW264.7細胞按照1.2.4培養(yǎng)，吸出原有的培養(yǎng)基，1000×g離心5 min收集細胞，PBS重懸，加入3μL FITC anti-mouse CD80 antibody，4℃避光孵育30 min，1000×g離心5 min，棄去上清，PBS洗滌一次，1000×g離心5 min，棄去上清，300μL重懸細胞，流式細胞術檢測M1型巨噬細胞標志CD80的表達。
1.2.6 A549細胞活力測定實驗
A549細胞按照密度3.0×104個細胞/孔鋪板，培養(yǎng)24 h，吸出原有的培養(yǎng)基，加入相應的條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，按照比例加入CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱孵育30 min，在450 nm處測定吸光度并計算。細胞存活率計算公式如下：
式中；A0為空白組的OD值；A樣本為實驗組的OD值；A空白為對照組OD值。
1.2.7 A549細胞周期實驗
A549細胞按6.0×104個細胞/孔接種于六孔培養(yǎng)板內，培養(yǎng)24 h，棄去原有培養(yǎng)基，加入相應的條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，室溫條件下，1000×g左右離心5 min，收集細胞，取細胞沉淀，按照細胞周期檢測試劑盒說明書對細胞進行染色處理，利用流式細胞儀檢測A549細胞周期的變化，運用分析軟件FlowJo 7.6分析細胞周期變化。
1.2.8 A549細胞凋亡實驗
細胞培養(yǎng)方法如1.2.7，使用胰酶消化，收集細胞到離心管中，1000 r/min離心5 min后棄去上清，加入400μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶染色液，混勻，37℃避光孵育20 min，用流式細胞分析儀檢測人參外泌體刺激巨噬細胞極化對A549細胞凋亡的影響。
1.2.9免疫印跡
細胞培養(yǎng)方法如1.2.7，收集細胞到離心管內，1000×g離心5 min，吸除上清，加入適量RIPA裂解液，充分裂解細胞。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并調整至相同濃度，利用十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分離，恒流220 mA轉膜90 min、使用5%PBS奶粉封閉1 h后，使用TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2一抗孵育過夜，回收一抗，PBST洗滌3次，二抗室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，使用iBright智能成像系統(tǒng)顯色并觀察條帶，用Image J軟件進行分析。
1.3數(shù)據(jù)處理
實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)資料采用均值±標準差（X±SD）表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P<0.05表示顯著性差異。
2.結果與分析
2.1人參外泌體對RAW264.7的細胞活力的影響
RAW264.7經(jīng)Tris-HCl、LPS以及不同濃度的人參外泌體處理24 h，與空白對照組相比，陰性對照組（Tris-HCl）對RAW264.7細胞沒有增殖作用；在陽性對照組（LPS）濃度為1μg·mL?1時，細胞活力顯著增強（P<0.01）；與空白對照組相比，隨著GDNPs濃度的增加，細胞活力在濃度為5~20μg·mL?1范圍內顯著增強，具有明顯的濃度依賴性，人參外泌體濃度為20μg·mL?1時RAW264.7的細胞活力最強（P<0.01），其次是人參外泌體濃度為10μg·mL?1（P<0.01），濃度為5μg·mL?1時細胞活力最弱（P<0.05）；與陰性對照組相比，不同濃度的人參外泌體給藥組對RAW264.7細胞活力的影響顯著增強（P<0.01）；與陽性對照組相比，不同濃度的人參外泌體對RAW264.7細胞活力的影響效果較弱（圖1）。
2.2人參外泌體對RAW264.7細胞中炎癥因子轉錄水平的影響
M1巨噬細胞在炎癥因子分泌和抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用，從而保護宿主免受各種細菌和病毒的侵害[24]?；趶V泛的研究，有人提出M1巨噬細胞在腫瘤細胞中的高浸潤與NSCLC患者的預后改善有關[25]。為了探討人參外泌體對巨噬細胞RAW264.7細胞極化的影響，采用實時定量PCR檢測巨噬細胞RAW264.7中IL-6、iNOS、TNF-α、MCP-1轉錄水平的表達情況，結果顯示（圖2），與空白對照組相比，LPS組IL-6、iNOS、MCP-1、TNF-α轉錄水平升高；不同劑量的人參外泌體處理后，與空白對照組相比，人參外泌體低劑量組iNOS、TNF-α轉錄水平顯著升高（P<0.01），IL-6、MCP-1無顯著差異；人參外泌體中劑量組iNOS、TNF-α轉錄水平顯著升高（P<0.01），IL-6、MCP-1無顯著差異；人參外泌體高劑量組IL-6、iNOS、MCP-1、TNF-α轉錄水平顯著升高（P<0.01）。因此，人參外泌體可顯著誘導巨噬細胞RAW264.7細胞向M1型極化。
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