摘要：目的:1.探討水飛薊賓對臨床常見感染細菌的體外抑菌活性及抑菌譜。2.探討水飛薊賓與臨床常用抗菌素的聯(lián)合作用。3.研究水飛薊賓的抑菌機制。
為開發(fā)新型抗菌藥物提供科學依據(jù)。方法:
1.水飛薊賓的抑菌活性檢測
(1)采用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓及其同分異構體(異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭)對臨床常見感染細菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌)標準菌株的最低抑菌濃度(MIC)。平行測定3次,取平均值。(2)采用平板菌落計數(shù)法測定不同濃度水飛薊賓對臨床常見感染細菌的標準菌株生長曲線的影響。實驗重復3次。(3)采用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓對常見感染細菌臨床分離菌株的最低抑菌濃度(MIC)。平行測定3次,取平均值。(4)采用棋盤微量肉湯稀釋法進行水飛薊賓與臨床常用抗菌素(革蘭陽性菌選用青霉素和紅霉素,革蘭陰性菌選用慶大霉素和環(huán)丙沙星)聯(lián)合藥敏試驗,測定在聯(lián)合用藥的情況下,水飛薊賓對細菌的最低抑菌濃度(MIC)及抗菌素對細菌的最低抑菌濃度(MIC),并計算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC)。實驗重復3次。
2.水飛薊賓的抑菌機制研究
(1)水飛薊賓對表皮葡萄球菌細胞膜完整性的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細菌0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、5 h、7 h和9 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后取樣,使用考馬斯亮蘭-分光光度法分別檢測各作用時間點細菌培養(yǎng)液中胞外蛋白濃度(平行測3次),繪制蛋白濃度—作用時間曲線,并比較實驗組與對照組的差異性。(2)水飛薊賓對表皮葡萄球菌菌體蛋白代謝的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細菌12 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后,將各菌懸液稀釋到相同濃度(相同OD值),取等體積離心,制備菌體可溶性蛋白,然后進行SDS-PAGE電泳,對凝膠圖譜進行拍照分析。重復實驗3次。(3)水飛薊賓對表皮葡萄球菌核酸代謝的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細菌6 h、12 h、24 h和48 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后取樣,將各菌懸液稀釋到相同濃度(相同OD值)后,各取等體積的量與DAPI染液反應,然后于熒光分光光度計上分別測定菌體的DNA熒光強度和RNA熒光強度(平行測3次),并采用SPSS 21.0對二者結果進行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。(4)水飛薊賓對表皮葡萄球菌DNA拓撲異構酶活性的影響:pBR322 DNA主要以超螺旋形式(FormⅠ)存在,而拓撲異構酶可以將pBR322 DNA超螺旋形式解旋為開環(huán)或線性DNA(FormⅡ)。1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別于37℃對細菌DNA拓撲異構酶和pBR322 DNA混合物作用30 min(對照組用DMSO代替水飛薊賓)后,通過凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)觀察pBR322 DNA存在的形式,獲得水飛薊賓對表皮葡萄球菌DNA拓撲異構酶的影響。實驗重復3次。(5)水飛薊賓對表皮葡萄球菌生物膜的影響:用1 MBIC和2 MBIC水飛薊賓分別作用于各階段(6 h、24 h和48 h)的生物膜,于37℃培養(yǎng)過夜。然后,用結晶紫染色法對生物膜進行半定量測定,運用SPSS 21.0對吸光度值進行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義;最后用激光共聚焦技術直接觀察水飛薊賓對生物膜形態(tài)結構的影響。實驗均重復3次。
結果:1.水飛薊賓的抑菌活性(1)水飛薊賓對革蘭陽性菌標準菌株的最小抑菌濃度(MIC)范圍為50-400μg/mL,其中對表皮葡萄球菌表現(xiàn)出最強的抑菌活性,MIC值為50μg/mL,而該藥對革蘭陰性菌標準菌株MIC值范圍為>400μg/mL;在水飛薊賓的同分異構體中,異水飛薊賓對表皮葡萄球菌、屎腸球菌和糞腸球菌標準菌株的MIC均為400μg/mL,其他同分異構體對臨床常見感染細菌的標準菌株的MIC值均>400μg/mL。(2)水飛薊賓對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌生長曲線有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度的增加,抑制效果越顯著,而該藥對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的生長曲線沒有任何影響。(3)水飛薊賓對臨床分離革蘭陽性菌株的MIC值:表皮葡萄球菌為≥100μg/mL,金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌均為≥400μg/mL;水飛薊賓對臨床分離革蘭陰性菌株的MIC值均>400μg/mL。(4)在聯(lián)合藥敏試驗中,對于革蘭陽性菌,水飛薊賓與青霉素/紅霉素的聯(lián)合抑菌指數(shù)均以0.5