研究簡(jiǎn)介：有效的定殖對(duì)于微生物對(duì)其宿主發(fā)揮潛在的有毒或有益功能是必要的1。由于土壤微生物的高度多樣性和激烈競(jìng)爭(zhēng)，快速定殖對(duì)于土壤細(xì)菌占據(jù)根部營養(yǎng)豐富的生態(tài)位非常重要。植物根際促生長(zhǎng)細(xì)菌（PGPR）由于其多功能的植物有益特性而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。鐵在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，也是根際中的有限資源，其中棲息的微生物爭(zhēng)奪這種必需的礦物質(zhì)營養(yǎng)素。植物病原體從宿主細(xì)胞中回收鐵，而植物則利用鐵保留策略來對(duì)抗病原體感染。貝萊斯芽孢桿菌SQR9是一種經(jīng)過充分研究的PGPR，它可以在根部定殖，通過促進(jìn)生長(zhǎng)和控制疾病來使植物受益。貝萊斯芽孢桿菌SQR9使用鐵載體和特定的鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來獲取鐵，從而支持生物膜形成和根部定殖。為了與宿主建立相互作用，一系列與動(dòng)物和植物相關(guān)的病原菌和共生細(xì)菌已經(jīng)發(fā)展出獨(dú)特的分泌系統(tǒng)，將某些蛋白質(zhì)跨膜或疏水結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外空間。在這些系統(tǒng)中，VII型分泌系統(tǒng)（T7SS）是厚壁菌門和放線菌門所獨(dú)有的。最近的研究表明，EsxA（結(jié)核分枝桿菌T7SS分泌的核心蛋白）在T7SS介導(dǎo)的毒力中發(fā)揮著核心作用，包括吞噬體膜的擾動(dòng)。T7SS在芽孢桿菌屬物種15中也是保守的，其中yuk/yue操縱子編碼用于分泌YukE的T7SS，YukE與分枝桿菌中的EsxA同源。研究人員發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SQR9的T7SS及其分泌蛋白YukE導(dǎo)致植物根部鐵滲漏，這有助于貝萊斯芽孢桿菌SQR9在根部定植。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，T7SS分泌的YukE可能通過直接插入根質(zhì)膜而導(dǎo)致根部鐵滲漏。


Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用


Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀主要用于測(cè)量B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生長(zhǎng)曲線。Bioscreen C系統(tǒng)通過每小時(shí)測(cè)量OD600值來監(jiān)測(cè)細(xì)菌在LB培養(yǎng)基或修改后的MSgg培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。這種監(jiān)測(cè)是自動(dòng)化的，可以連續(xù)記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，為研究者提供了關(guān)于細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的詳細(xì)信息。通過使用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，研究者能夠評(píng)估不同條件下（如在不同鐵濃度的培養(yǎng)基中）B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生長(zhǎng)能力。這對(duì)于理解T7SS和YukE在細(xì)菌生長(zhǎng)和鐵獲取中的作用至關(guān)重要，因?yàn)殍F是細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵營養(yǎng)素。此外，通過比較野生型和突變株的生長(zhǎng)曲線，研究者可以評(píng)估T7SS和YukE對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果


T7SS和YukE對(duì)于B.velezensis SQR9在植物根部的定植至關(guān)重要。通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)缺失T7SS或YukE的突變株在根部定植能力上顯著下降。YukE能夠插入植物的細(xì)胞膜，導(dǎo)致根部鐵泄漏。這種鐵泄漏在植物與SQR9的相互作用中起到了促進(jìn)作用，因?yàn)殍F的可用性增加有助于SQR9的定植。提出了YukE通過直接插入植物根細(xì)胞膜來引起鐵泄漏的機(jī)制。這一過程在接種初期最為顯著，且在24小時(shí)后逐漸減弱。通過鐵染色和ICP-MS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)WT SQR9處理的植物根部鐵含量顯著降低，而YukE的突變株或熱處理YukE無法復(fù)制這一效應(yīng)。在高鐵環(huán)境下，T7SS的表達(dá)和YukE的分泌增加，表明鐵水平可能通過正反饋機(jī)制調(diào)節(jié)YukE的產(chǎn)生和活性。YukE能夠引起根部鐵泄漏，但它對(duì)植物生長(zhǎng)沒有負(fù)面影響，甚至可以增強(qiáng)SQR9對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。揭示了貝萊森巴伯菌SQR9的T7SS及其分泌蛋白YukE導(dǎo)致植物根部鐵滲漏，從而促進(jìn)貝萊森巴伯菌SQR9在根部定殖。

圖1、貝萊斯芽孢桿菌SQR9和tT7SS對(duì)根定植的貢獻(xiàn)。a）編碼T7SS的yuk/yue操縱子的示意圖。紅色箭頭表示編碼分泌型WXG100家族蛋白YukE的基因，綠色箭頭表示編碼輸出機(jī)制的基因。b）基于72個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)集的yuk/yue操縱子的轉(zhuǎn)錄相關(guān)性。計(jì)算皮爾遜相關(guān)性；顏色表示每對(duì)基因之間轉(zhuǎn)錄相關(guān)性的R值：黃色表示高相關(guān)性，藍(lán)色表示低相關(guān)性。c）培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡測(cè)定。d）上清液和細(xì)胞裂解液中YukE的含量。測(cè)量一份樣品的整個(gè)培養(yǎng)物、上清液和細(xì)胞裂解物，并記錄OD 600以指示細(xì)胞密度。數(shù)據(jù)以平均值±sem（n=6）表示。虛線表示5μM純化的YukE-GFP的熒光密度。e,f）WT SQR9、突變體和互補(bǔ)菌株在水培環(huán)境中生長(zhǎng)的擬南芥(e)和黃瓜(f)根上的定殖。在接種后第2天測(cè)量定植的細(xì)菌細(xì)胞。

圖2、SQR9衍生菌株和YukE對(duì)植物鐵含量的影響。a）接種B.velezensis SQR9或用YukE處理的15天齡擬南芥根的Perls染色圖像。b）接種后24小時(shí)，15天齡擬南芥根部鐵的Perls染色的顯微鏡視圖。對(duì)于每次處理，檢查12個(gè)根的成熟區(qū)。c）b中Perls染色的定量分析。d–f）ICP-MS測(cè)量用YukE或SQR9衍生菌株處理的15日齡擬南芥根部在12小時(shí)(d)、24小時(shí)(e)和48小時(shí)(f)時(shí)的鐵含量。接種后P=0.815。g）通過ICP-MS測(cè)量接種后12小時(shí)，YukE梯度劑量對(duì)15日齡擬南芥根鐵含量的影響。h）接種后24小時(shí)K252a和BFA對(duì)YukE根細(xì)胞降鐵能力的影響。

圖3、YukE介導(dǎo)的根部鐵滲漏有助于SQR9的根部定殖。a）水培條件下，接種后2天，B.velezensis SQR9在15天齡的擬南芥根上定殖。b)接種后24小時(shí)，15日齡擬南芥根際細(xì)菌細(xì)胞獲得的鐵的ICP-MS測(cè)量。將野生型SQR9或突變體接種到含有常規(guī)鐵(90μM)的中等生長(zhǎng)的15天齡擬南芥植物中。分別在接種后0小時(shí)和24小時(shí)通過劇烈洗滌和離心收集細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌鐵獲取量計(jì)算為接種后24小時(shí)的鐵含量減去接種后0小時(shí)的鐵含量。c)ICP-MS測(cè)量體外細(xì)菌細(xì)胞的鐵含量。用5μM YukE處理15天的擬南芥植物12小時(shí)以防止鐵滲漏。

圖4、YukE在15天齡擬南芥細(xì)胞表面的功能和位置。a）接種或處理后24小時(shí)YukE在根表面的位置。用B.velezensis SQR9 yukE::yukE-gfp（終濃度為107個(gè)細(xì)胞/ml）接種擬南芥根，或用純化的YukE-GFP（終濃度為5μM）處理。包括對(duì)根部進(jìn)行劇烈清洗步驟以去除未附著的細(xì)菌細(xì)胞和蛋白質(zhì)。b）a中所示的GFP和FM4-64信號(hào)的共定位分析。括號(hào)中的數(shù)字表示根據(jù)a中的所有重復(fù)計(jì)算得出的標(biāo)準(zhǔn)誤差。c）接種后48小時(shí)YukE在根表面的位置。比例尺，100μm。d）c中所示的GFP和FM4-64信號(hào)的共定位分析。e）接種后2天，YukE-GFP和質(zhì)膜標(biāo)記PM-mCherry在本塞姆氏煙草葉細(xì)胞中的共定位。包括三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，100μm。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，結(jié)果相似。f）e中所示的GFP和RFP信號(hào)的共定位分析。g）YukE對(duì)PI染色根細(xì)胞核的影響。

圖5，YukE插入植物質(zhì)膜。a、b）接種后24小時(shí)，YukE變體對(duì)PI根細(xì)胞核染色(a)和鐵Perls染色(b)的影響。每幅圖像下方的分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞核被PI染色的次數(shù)。比例尺，100μm。藍(lán)色染色代表鐵。c）接種后12小時(shí)用YukE變體處理的15天齡擬南芥根部的鐵含量的ICP-OES測(cè)量。d）AlphaFold 2預(yù)測(cè)的YukE的3D結(jié)構(gòu)。黃色殘基表示用NBD標(biāo)記的用于測(cè)試質(zhì)膜插入的位點(diǎn)。e，f，熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到Y(jié)ukE在葉（e）或根（f）原生質(zhì)體上的膜插入。圖像是在混合后15小時(shí)拍攝的。每個(gè)處理包括三個(gè)重復(fù)。比例尺，20μm。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，結(jié)果相似。g,h，e(g)和f(h)中微觀視圖的定量分析。i，NBD標(biāo)記的YukE變體在人工脂質(zhì)體上插入的定量分析。j，從脂質(zhì)體釋放的鐵的定量分析。


總結(jié)


本研究主要探討了植物共生菌Bacillus velezensis SQR9的VII型分泌系統(tǒng)（T7SS）及其主要分泌蛋白YukE在促進(jìn)植物根部定植中的作用。研究揭示了T7SS和YukE在根際細(xì)菌與植物相互作用中的重要性，特別是在鐵這一關(guān)鍵營養(yǎng)元素的獲取和利用方面。研究發(fā)現(xiàn)YukE能夠插入植物細(xì)胞膜，導(dǎo)致根部鐵泄漏，從而為B.velezensis SQR9的定植提供有利條件。這種鐵泄漏在植物與SQR9的相互作用中起到了促進(jìn)作用，因?yàn)殍F的可用性增加有助于SQR9的定植。此外研究還發(fā)現(xiàn)YukE的分泌和活性受到鐵水平的調(diào)節(jié)，表明鐵水平可能通過正反饋機(jī)制調(diào)節(jié)YukE的產(chǎn)生和活性。通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)缺失T7SS或YukE的突變株在根部定植能力上顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)了T7SS和YukE在B.velezensis SQR9根部定植中的關(guān)鍵作用。此外，研究還探討了環(huán)境鐵水平對(duì)YukE分泌和T7SS表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在高鐵環(huán)境下，T7SS的表達(dá)和YukE的分泌增加。這項(xiàng)研究不僅增進(jìn)了研究人員對(duì)植物共生菌如何通過T7SS和YukE與植物相互作用的理解，而且對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物健康具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在本論文研究過程中，Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的使用為研究提供了一個(gè)高效且準(zhǔn)確的方法來監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)，這對(duì)于理解細(xì)菌與植物相互作用的分子機(jī)制以及開發(fā)潛在的農(nóng)業(yè)應(yīng)用具有重要意義。通過這種分析，研究者可以更好地理解T7SS和YukE在植物共生菌與植物相互作用中的作用，以及它們?nèi)绾斡绊懼参锏蔫F營養(yǎng)和根部微生物相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)還有助于研究人員更好地理解植物根部微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，為根際工程和植物微生物組研究提供了新的視角。


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