2.3健康易感豬篩選
用競爭ELISA方法和試管凝集方法同時檢測30份豬血清中的豬丹毒抗體，將血清抗體PI值≤10.0%的豬判定為抗體陰性豬。結(jié)果（表2）顯示，28頭豬PI值均≤10.0%且試管凝集試驗結(jié)果均為陰性，另外2頭豬PI值分別為12.4和11.0，且試管凝集試驗結(jié)果均為可疑。
表2豬血清抗體檢測結(jié)果
2.4 CVCC43005株對豬最小致死劑量測定
結(jié)果（表3）顯示，以3.5×1010CFU活菌靜脈注射56～63日齡健康易感豬，2只試驗豬在4 d內(nèi)全部死亡，病死豬表現(xiàn)為精神沉郁、喜臥、不愿走動、厭食、頸部出現(xiàn)暗紅色丘疹（圖2）。說明CVCC43005株對豬最小致死劑量為3.5×1010CFU/頭。
表3 CVCC43005株對豬最小致死劑量測定
圖2發(fā)病豬頸部出現(xiàn)暗紅色丘疹
2.5不同凍干代次CVCC43005株菌種毒力檢定
1986、1996、2006、2015年4個凍干代次的CVCC43005株菌種按照最小致死劑量攻擊豬，均可使豬全部死亡，毒力檢定結(jié)果（表4）均符合要求。根據(jù)不同凍干代次CVCC43005株菌種毒力檢定結(jié)果，CVCC43005株菌種毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)為取56～63日齡健康易感豬2頭，經(jīng)靜脈注射菌液5.0 mL/頭（活菌濃度不高于7.0×109CFU/mL），觀察4 d，應(yīng)全部死亡；取18～22 g小白鼠5只，經(jīng)皮下注射菌液0.2 mL/只（活菌濃度不高于50 CFU/mL），觀察7 d，應(yīng)全部死亡。
表4不同凍干代次CVCC43005株菌種毒力檢定結(jié)果
2.6不同凍干代次CVCC43005株菌種免疫原性檢定
4個凍干代次的菌株制備成滅活抗原后，分別按滅活抗原0.1 mL及滅活抗原40%氫氧化鋁膠生理鹽水4倍稀釋液0.2 mL免疫小鼠。結(jié)果（表5）顯示，攻擊1 000 MLD強(qiáng)毒菌液免疫組小鼠全部健活，對照組小鼠全部死亡，攻擊1 MLD CVCC43006強(qiáng)毒菌液對照組小鼠全部死亡，攻擊1 MLD CVCC43008強(qiáng)毒菌液對照組小鼠死亡4只。說明符合毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)的菌種，其免疫原性檢定亦符合要求。
表5不同凍干代次菌株對小鼠的免疫原性單位：只
3討論
《規(guī)程》對豬丹毒絲菌C43-5的毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)為“以肉肝胃消化湯培養(yǎng)24 h的菌液1～5 mL（每1 mL不少于活菌30億），靜脈注射斷奶后1～3個月體質(zhì)量20 kg以上的健康易感豬2頭，應(yīng)于4 d內(nèi)死亡；5～10個活菌注射18～22 g小白鼠5只，均應(yīng)于7 d內(nèi)死亡”?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中主要存在兩個問題：一是原標(biāo)準(zhǔn)中對豬的毒力標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了攻毒菌數(shù)的下限“每1 mL不少于活菌30億”，沒有規(guī)定上限，檢定過程中可以不斷增加攻毒菌數(shù)，直至豬死亡，相當(dāng)于菌株沒有毒力標(biāo)準(zhǔn)；二是原標(biāo)準(zhǔn)動物日齡過于寬泛，跨度3個月，豬的體質(zhì)量有較大差別，對菌株的抵抗力也大不相同。為解決上述問題，本研究對豬丹毒絲菌C43-5株在肉肝胃消化湯中的生長規(guī)律進(jìn)行了分析，縮小了檢驗動物日齡范圍，測定了菌株對規(guī)定日齡范圍豬的最小致死劑量，并對1986、1996、2006、2015年4個凍干代次的菌種進(jìn)行了毒力和免疫原性測定。
通過分析豬丹毒絲菌C43-5株在肉肝胃消化湯中的生長曲線，選用培養(yǎng)16 h的菌液，初步探索出了更為合理的菌種毒力檢定標(biāo)準(zhǔn)：選擇56～63日齡健康易感豬2頭，經(jīng)靜脈注射菌液5.0 mL/頭（活菌數(shù)不高于7.0×109CFU/mL），觀察4 d，應(yīng)全部死亡；取18～22 g小白鼠5只，經(jīng)皮下注射菌液0.2 mL/只（活菌數(shù)不高于50 CFU/mL），觀察7 d，應(yīng)全部死亡。同時，本研究對4個凍干代次菌種進(jìn)行了毒力和免疫原性測定，發(fā)現(xiàn)4個代次的菌種毒力和免疫原性均符合規(guī)定。目前，豬丹毒菌種每隔10年需要進(jìn)行1次制備和檢定，包括復(fù)壯、凍干、真空度測定、純粹檢驗、剩余水分測定、培養(yǎng)特性、生化特性、毒力、免疫原性等步驟，費(fèi)時費(fèi)力。而本研究結(jié)果顯示，保存36、26、16年菌種的毒力、免疫原性均可達(dá)到菌種的檢定標(biāo)準(zhǔn)，這為進(jìn)一步延長菌種的保存時間提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。
相關(guān)新聞推薦
1、中草藥大青葉對酒曲發(fā)酵過程酒曲理化參數(shù)及微生物活性的影響（三）
2、貯藏溫度對鮮切草魚薄片中熱死環(huán)絲菌的生長速率影響（一）
3、我國牛A群輪狀病毒優(yōu)勢分離株SDA2毒株培養(yǎng)條件及生長曲線繪制