由于化石燃料消耗導致的氣候變化和環(huán)境惡化的挑戰(zhàn)，需要使用木質纖維素生物質作為原料高效生產(chǎn)第二代生物燃料。然而木質纖維素水解產(chǎn)物中存在的抑制劑會導致生長抑制和發(fā)酵效率受損。抑制劑主要包括乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛(5-HMF)等。酵母細胞絮凝是一種無性、可逆、鈣依賴性細胞聚集，廣泛用于經(jīng)濟有效地從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離生物質。自絮凝酵母菌株SPSC01已用于工業(yè)連續(xù)乙醇發(fā)酵。絮凝賦予酵母細胞提高對乙醇和乙酸脅迫的耐受性。研究表明，操縱多個基因，如RTC1、ACS1、RCK1、PMA1、CCW12和ADY2，可以賦予酵母細胞更高的乙酸抗性。通過操縱蛋白激酶來提高酵母穩(wěn)健性的研究仍然有限。膜磷酸蛋白質組分析已用于研究釀酒酵母對乙酸脅迫（在pH 4.0下暴露于50 mM乙酸1小時）的早期反應，并確定調節(jié)各種轉運蛋白的蛋白激酶Hrk1參與乙酸脅迫酸應激反應。然而到目前為止，還沒有關于多組學數(shù)據(jù)的綜合分析來研究對乙酸脅迫的適應性反應和培育強健酵母菌株的報道。膜磷酸蛋白質組分析已用于研究釀酒酵母對乙酸脅迫（在pH 4.0下暴露于50 mM乙酸1小時）的早期反應，并確定調節(jié)各種轉運蛋白的蛋白激酶Hrk1參與乙酸脅迫酸應激反應。然而到目前為止，還沒有關于多組學數(shù)據(jù)的綜合分析來研究對乙酸脅迫的適應性反應和培育強健酵母菌株的報道。研究人員通過比較乙酸脅迫下的絮凝和非絮凝菌株，進行轉錄組、蛋白質組和磷酸蛋白質組，以探索關鍵的應激反應蛋白。確定了幾種關鍵的蛋白激酶，可以通過操縱它們來提高酵母的應激耐受性并增強纖維素乙醇的發(fā)酵。這項工作的結果為使用工業(yè)酵母高效生產(chǎn)纖維素乙醇提供了基礎。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
首先將菌株培養(yǎng)過夜并轉移至新鮮的YPD培養(yǎng)基中。當種子生長到指數(shù)生長期時，通過3,000轉速離心3分鐘收集細胞，用無菌蒸餾水洗滌，并接種到微量滴定板中初始OD600為0.1的發(fā)酵培養(yǎng)基中。在Bioscreen C中，每0.5小時測量并記錄酵母菌株的細胞生長(OD600)。菌株的培養(yǎng)條件控制在30℃、中速振蕩。對于壓力耐受性測試，4 g/L糠醛或10 mM H2O2將添加到培養(yǎng)基中。工程酵母菌株的生長在搖瓶中通過Bioscreen C（Bioscreen，芬蘭）進行評估。
實驗結果
多組學數(shù)據(jù)的綜合分析揭示了乙酸脅迫下酵母細胞絮凝導致多種蛋白激酶表達及其蛋白磷酸化狀態(tài)的變化。蛋白激酶Hog1和解毒酶基因GPX1的過度表達提高了應激耐受性。隨后，與Hog1相互作用的關鍵蛋白激酶基因的過度表達增強了使用玉米芯水解物的乙酸耐受性和發(fā)酵性能。特別是通過過表達蛋白激酶基因AKL1，比生長率提高了40.0%，乙醇生產(chǎn)率提高了92.9%。這些結果提供了通過操縱關鍵蛋白激酶來提高纖維素乙醇產(chǎn)量的替代策略。
圖1、通過酵母細胞絮凝提高醋酸耐受性。A，絮凝菌株SPSC01和非絮凝菌株PLY01（SPSC01-ΔFLO1）的觀察。上圖，搖瓶培養(yǎng)物的照片；下圖：光學顯微鏡下的圖像。B，兩個菌株在5.0 g/L乙酸存在下的乙醇發(fā)酵。
圖2、提高的抗氧化能力賦予細胞對乙酸更高的抵抗力。A，乙醇發(fā)酵過程中在有或沒有5.0 g/L乙酸脅迫的情況下SPSC01和PLY01中ROS的積累。B，5.0 g/L乙酸脅迫下SPSC01和PLY01的GPX活性。C和D，PLY01和PLY01-GPX1在5.0g/L乙酸脅迫下的生長和乙醇發(fā)酵性能。
圖3、Hog1是對乙酸反應的關鍵調節(jié)因子。A）通過比較SPSC01及其非絮凝突變體PLY01獲得的磷酸化蛋白質組學數(shù)據(jù)中的富集磷酸化殘基基序，通過MOMO檢測到。B和C，親本菌株PLY01、HOG1過表達菌株PLY01-HOG1和HOG1缺失菌株PLY01-ΔHOG1在5.0 g/L乙酸脅迫下的生長和發(fā)酵性能。在PLY01和PLY01-HOG1中測試了D和E、ROS積累和GPX活性。
圖4、多種蛋白激酶與Hog1相互作用并導致醋酸耐受性。A和B）在5.0 g/L乙酸存在下，使用過表達六種選定蛋白激酶基因的重組酵母菌株和對照菌株PLY01的細胞生長和乙醇發(fā)酵性能。C）通過酵母雙雜交系統(tǒng)驗證了Hog1在體內(nèi)與選定的蛋白激酶相互作用。PC，陽性對照。NC，陰性對照。AD、GAL4激活域。BD、GAL4 DNA結合域。AD和BD分別與Hog1或靶蛋白激酶融合。
圖5、關鍵蛋白激酶和抗氧化應激相關基因的過度表達可改善纖維素乙醇發(fā)酵。A和B，基因過表達菌株在含有模擬玉米秸稈水解產(chǎn)物抑制劑混合物的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長和乙醇發(fā)酵。C和D，使用玉米芯水解產(chǎn)物的PLY01、PLY01-HOG1和PLY01-AKL1的生長和乙醇發(fā)酵。
總結
細胞自絮凝賦予酵母菌株改善的環(huán)境脅迫耐受性，有利于生物生產(chǎn)。探索絮凝細胞和非絮凝細胞之間代謝和調控網(wǎng)絡的差異，有利于開發(fā)具有令人滿意的發(fā)酵效率的菌株。在這項工作中，研究人員使用絮凝酵母釀酒酵母對轉錄組、蛋白質組和磷酸蛋白質組進行了綜合分析SPSC01及其非絮凝突變體在乙酸脅迫下生長，結果揭示了蛋白激酶的顯著變化。通過絮凝上調的絲裂原激活蛋白激酶Hog1的過度表達導致ROS積累減少和谷胱甘肽過氧化物酶活性增加，從而導致壓力下乙醇產(chǎn)量的提高。在測試的七個編碼蛋白激酶的基因中，AKL1在過表達時表現(xiàn)出最佳性能，在玉米芯水解產(chǎn)物和模擬玉米秸稈水解產(chǎn)物中實現(xiàn)了更高的乙醇生產(chǎn)率。這些結果為通過改造釀酒酵母中的關鍵蛋白激酶來提高纖維素乙醇的生產(chǎn)提供了替代策略。
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