銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)存在于自然界中，是人體內(nèi)常見的機會致病菌，同時也是最容易產(chǎn)生生物膜的革蘭陰性桿菌之一。近年來，由于抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致其耐藥性菌株頻繁出現(xiàn)。碳青霉烯類抗生素通常被用作臨床干預(yù)由銅綠假單胞菌引起的多重耐藥感染的最后手段。大量耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的出現(xiàn)給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)。
銅綠假單胞菌嚴(yán)重影響免疫功能低下的患者，是造成接受化療的中性粒細胞減少性癌癥患者菌血癥和敗血癥的主要原因，在各種皮膚感染中包括糖尿病足、燒傷創(chuàng)面、角膜潰瘍、外耳道感染性中也經(jīng)常出現(xiàn)。此外，患有囊性纖維化的患者通常會慢性感染銅綠假單胞菌，最終導(dǎo)致患者因肺功能衰竭而死亡。
噬菌體(bacteriophage，phage)是一類感染細菌的病毒，其結(jié)構(gòu)簡單、數(shù)量龐大、分布廣泛，在治療抗生素耐藥細菌方面，噬菌體有潛力作為抗菌劑用于多重耐藥菌引起的感染。噬菌體具有裂解能力強、繁殖快、成本低、不易產(chǎn)生耐藥性等特點不僅可以高效裂解細菌，還可以與多種抗生素協(xié)同作用，增強殺菌效果。目前已經(jīng)有多個噬菌體以及噬菌體與抗生素聯(lián)合應(yīng)用于臨床并治療成功的案列，故噬菌體療法被認(rèn)為是一種最具有希望用來對抗日益嚴(yán)重的耐藥細菌的生物防控手段。
銅綠假單胞菌Pa021的分離及鑒定
實驗菌株是從江蘇省婦幼保健院污水處理中心分離獲得。取少量污水樣本涂布至血平板上，35℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落，四區(qū)劃線至血平板上，直至菌落生長均一。于VITEK進行細菌鑒定及藥敏試驗，確定為銅綠假單胞菌，將其命名為Pa021。銅綠假單胞菌Pa021藥敏結(jié)果見表1。銅綠假單胞菌Pa021菌落生長形態(tài)見圖1。
圖1是實施例宿主菌銅綠假單胞菌Pa021的菌落生長狀態(tài)圖。
圖2是噬菌體Phage_Pae01的一步生長曲線圖。
噬菌體Phage_Pae01的一步生長曲線
隨機挑取1個宿主菌Pa021單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)早期；噬菌體與細菌按照MOI為0.01混合，室溫反應(yīng)8min，10000rpm離心30s，留沉淀；吸取3mL LB液體培養(yǎng)基吹打沉淀，室溫10000rpm離心30s，留沉淀后再次吹打；最后，用預(yù)熱的5mL LB液體培養(yǎng)基充分重懸；隨后在37℃、180rpm的恒溫搖床中培養(yǎng)；開始計時，每隔5min取樣一次取至30min，然后每隔10min取樣一次，取5次至100min，取出的100μL樣品12000rpm離心2min后收集上清；所得濾液置于4℃冰箱中，100min后，將各個時間所得的濾液倍比稀釋，雙層瓊脂平板法測滴度，實驗重復(fù)3次。得知：噬菌體Phage_Pae01的潛伏期為30min，裂解期為20～30min，隨后進入平穩(wěn)期。
噬菌體Phage_Pae01的殺菌曲線繪制
取150μL過夜培養(yǎng)宿主菌液加入15mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，OD600為0.50。取無菌96孔板，在孔中加入140μL LB液體培養(yǎng)基及30μL對數(shù)期宿主菌液，按不同的MOI(10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001)做好標(biāo)記，分別加入109-104滴度的噬菌體懸液30μL，對照組使用LB液體培養(yǎng)基代替噬菌體，每個孔設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置溫度37℃，每間隔30min測一次OD600，共測18h。與不加噬菌體的對照組相比，在不同的MOI條件下，細菌的生長逐漸被抑制并被殺滅，體現(xiàn)噬菌體Phage_Pae01的殺菌效果較強。
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