耐藥菌的出現(xiàn)和傳播導(dǎo)致全世界范圍內(nèi)由細(xì)菌感染引起的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)不斷增多。2016年，世界衛(wèi)生組織制定了一份除結(jié)核分支桿菌外的耐藥菌優(yōu)先清單，其中較為重要的臨床優(yōu)先級(jí)細(xì)菌包括耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌以及耐碳青霉烯和三代頭孢菌素的腸桿菌科細(xì)菌。2008年出現(xiàn)的新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New DelhiMetallo-β-lactamase,NDM-1)是一種重要的碳青霉烯酶，可以水解包括碳青霉烯類(lèi)抗生素在內(nèi)的絕大部分β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，導(dǎo)致耐藥菌引起的感染難以治療。研究開(kāi)發(fā)有效的NDM-1酶抑制劑與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素聯(lián)用是治療NDM-1陽(yáng)性菌感染的有效途徑之一。雖然目前臨床上已有多種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑投入使用，如克拉維酸、舒巴坦等，但仍沒(méi)有針對(duì)NDM-1的酶抑制劑投入使用。因此，開(kāi)發(fā)新型安全有效的NDM-1酶抑制劑具有十分重要的意義。
去甲澤拉木醛是一種從雷公藤中提取的三萜烯化合物，在雷公藤中的含量較高，具有抗炎、免疫抑制和抗腫瘤活性。去甲澤拉木醛能夠顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化，還可以阻斷典型和非典型TGF-β信號(hào)通路，抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞入侵。但并沒(méi)有去甲澤拉木醛作為抗生素佐劑的報(bào)道，因此本研究針對(duì)去甲澤拉木醛作為抑制NDM-1活性的美羅培南佐劑展開(kāi)研究。
本研究通過(guò)頭孢硝噻吩水解試驗(yàn)，從天然化合物庫(kù)中篩選獲得了一種NDM-1酶抑制劑去甲澤拉木醛，其可有效抑制NDM-1的活性。通過(guò)棋盤(pán)法最小抑菌濃度試驗(yàn)證明了去甲澤拉木醛與碳青霉烯類(lèi)抗生素美羅培南有良好的協(xié)同抑菌效果，通過(guò)生長(zhǎng)曲線(xiàn)和殺菌曲線(xiàn)試驗(yàn)證明了去甲澤拉木醛與美羅培南的協(xié)同殺菌效果。進(jìn)一步通過(guò)大蠟螟感染模型驗(yàn)證了去甲澤拉木醛可有效增強(qiáng)美羅培南的體內(nèi)治療效果。
圖為去甲澤拉木醛聯(lián)合美羅培南對(duì)NDM-1臨床分離株E.coli ZJ487的生長(zhǎng)曲線(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果
圖為去甲澤拉木醛聯(lián)合美羅培南對(duì)NDM-1臨床分離株E.coli ZJ487的殺菌曲線(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果
生長(zhǎng)曲線(xiàn)試驗(yàn)
將過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌E.coli ZJ487轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中，待OD600nm至0.1～0.3，分裝至50mL離心管中，同時(shí)加入不同濃度去甲澤拉木醛使其終濃度為0、8、32、128μg/mL，37℃，180rpm/min連續(xù)培養(yǎng)，每隔1h測(cè)定其在OD600nm的吸光值，記錄并繪制成曲線(xiàn)。
結(jié)論：低于128μg/mL的去甲澤拉木醛對(duì)大腸桿菌E.coli ZJ487的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。
4.殺菌曲線(xiàn)試驗(yàn)
對(duì)于大腸桿菌E.coli ZJ487，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、單獨(dú)美羅培南(4μg/mL)、單獨(dú)去甲澤拉木醛(64μg/mL)、聯(lián)合處理組；每組菌量均為5×105
CFUs，37℃靜置培養(yǎng)。在0、4、8、12、24h時(shí)間點(diǎn)分別取出樣品稀釋不同倍數(shù)涂板，24h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量并記錄。
結(jié)論：去甲澤拉木醛與美羅培南聯(lián)合使用可在24h內(nèi)完全殺滅NDM-1陽(yáng)性臨床分離株E.coli ZJ487。
結(jié)論：25mg/kg去甲澤拉木醛聯(lián)合1mg/kg美羅培南可將美羅培南的保護(hù)效果從50％提高至70％，顯著高于對(duì)照組或單獨(dú)去甲澤拉木醛治療。
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