目的通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人胚肺二倍體細(xì)胞不同代次情況，篩選評(píng)價(jià)人胚肺二倍體細(xì)胞衰老程度的生物學(xué)指標(biāo)。方法將Walvax-2細(xì)胞分為16個(gè)代次，繪制生長(zhǎng)曲線，觀察不同代次Walvax-2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況及細(xì)胞活力；通過(guò)核酸熒光染料碘化丙啶(PI)作為細(xì)胞活力分析的熒光探針使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同代次Walvax-2細(xì)胞周期時(shí)相和細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果P20和P30的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P40和P50(均P<0.05)，P40的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P50(P<0.05)；G0/G1期所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長(zhǎng)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，而S期、G2/M期和細(xì)胞碎片所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長(zhǎng)顯著相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線可區(qū)分相隔較大代次的Walvax-2細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，在進(jìn)行細(xì)胞衰老綜合評(píng)定時(shí)，可通過(guò)PI作為熒光探針使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化作為Walvax-2細(xì)胞的衰老程度綜合評(píng)定的指標(biāo)。
Walvax-2細(xì)胞20代、30代、40代和50代生長(zhǎng)曲線
體外培養(yǎng)的人類(lèi)細(xì)胞在分裂一定的次數(shù)之后就會(huì)停止增殖，稱(chēng)為細(xì)胞衰老。實(shí)際上在體外培養(yǎng)時(shí)不僅衰老的細(xì)胞逐漸增加，即使在年輕的細(xì)胞群體中也占有一定比例[2]，隨著分裂次數(shù)增多，細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的表型和基因表達(dá)改變，衰老細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞群體的生命周期中的百分比逐漸增大，直到所有的細(xì)胞均進(jìn)入老化狀態(tài)。其中，二倍體細(xì)胞與其他傳代細(xì)胞相比，理論上不存在致腫瘤的潛在危險(xiǎn)性[3-4]。其作為培養(yǎng)病毒疫苗時(shí)所需要的主要原材料，其質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量[5-6]。而細(xì)胞本身的特性也是疫苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的重點(diǎn)。我國(guó)已上市的疫苗中，甲型肝炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、風(fēng)疹減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗分別使用了2BS、KMB-17、MRC-5細(xì)胞[7-9]。
研究發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞的細(xì)胞代謝能力降低，會(huì)出現(xiàn)脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞成分損傷。在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中穩(wěn)定生長(zhǎng)停止、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性(senescence-associatedβ-galactosidase)、BMI-1基因、端粒酶RNA和p16(INK4A)的異質(zhì)性誘導(dǎo)等標(biāo)志物與細(xì)胞衰老密切相關(guān)[10-12]。目前，系統(tǒng)性評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老程度的研究尚未取得進(jìn)展[2,10-14]。本研究以通過(guò)檢測(cè)不同代次人胚肺二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞傳代周期中細(xì)胞構(gòu)成與細(xì)胞碎片變化情況等指標(biāo)值，篩選評(píng)價(jià)人胚肺二倍體細(xì)胞衰老程度的生物學(xué)指標(biāo)。
細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一[15]。但這種方法對(duì)同一樣品要求計(jì)數(shù)后取平均值，不但操作繁瑣和費(fèi)時(shí)，而且誤差較大，可達(dá)到20%～30%[16]。由于Walvax-2細(xì)胞具備自身穩(wěn)定生長(zhǎng)的特性，因而適合選用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。本研究結(jié)果顯示W(wǎng)alvax-2細(xì)胞增殖能力隨代齡增加而下降，符合了細(xì)胞衰老程度與細(xì)胞增殖能力的關(guān)系，指標(biāo)符合評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老程度的需求。
流式細(xì)胞儀將流體噴射技術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)等集于一體，既可定性又可定量，具有簡(jiǎn)單、快速和敏感性高的特點(diǎn)，可進(jìn)行多參數(shù)和活體細(xì)胞分析[17]。在細(xì)胞周期的分裂過(guò)程中可分為：M/G1、S、G2/M 3個(gè)時(shí)期。核酸熒光染料碘化丙啶[18]是一種常用的細(xì)胞核熒光染料，作為一種溴化乙錠的類(lèi)似物，PI可選擇性定量嵌入核酸雙螺旋堿基對(duì)之間，在激光激發(fā)下，能夠嵌入堿基對(duì)之間實(shí)現(xiàn)與雙鏈DNA結(jié)合，雖然PI不能穿透細(xì)胞膜而被排斥在活細(xì)胞外，但是可以穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞核染色[19]，因此PI可作為細(xì)胞活力分析的熒光探針之一。本研究檢測(cè)了Walvax-2細(xì)胞不同代次細(xì)胞周期3個(gè)時(shí)期中的細(xì)胞百分比，Walvax-2細(xì)胞的G2/M期、S期和細(xì)胞碎片均可以作為評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老程度的指標(biāo)。
綜上所述，在體外培養(yǎng)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線可區(qū)分相隔較大代次的Walvax-2細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，在進(jìn)行細(xì)胞衰老綜合評(píng)定時(shí)，可通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，作為Walvax-2細(xì)胞的衰老程度綜合評(píng)定的指標(biāo)。
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