2.4.生物膜形成
近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌生物膜在商業(yè)可得的預(yù)滅菌聚苯乙烯平底96孔微孔板上形成。向板每孔加入210μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)酵母細(xì)胞懸浮液（OD600 nm=0.8）和70μl麥芽提取物培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)對(duì)每種濃度進(jìn)行十六個(gè)重復(fù)孔。
2.5.藥物對(duì)粘附的效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對(duì)初始細(xì)胞粘附的影響，其中一種物質(zhì)從一開(kāi)始就與標(biāo)準(zhǔn)酵母細(xì)胞懸浮液一起加入孔中。微孔板用蓋子覆蓋并在30°C、150 rpm孵化24小時(shí)。
2.6.藥物對(duì)生物膜發(fā)展的效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對(duì)生物膜發(fā)展的影響，含標(biāo)準(zhǔn)酵母懸浮液的微孔板培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入其中一種物質(zhì)。在藥物加入前不洗滌孔以模擬天然作用機(jī)制的條件，其中物質(zhì)與粘附和懸浮細(xì)胞相互作用。微孔板用蓋子覆蓋并在30°C、150 rpm孵化24小時(shí)。
2.7.藥物對(duì)預(yù)形成生物膜的效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對(duì)預(yù)形成生物膜根除的影響，含標(biāo)準(zhǔn)酵母細(xì)胞懸浮液的微孔板培養(yǎng)24小時(shí)，然后每孔用鹽水洗滌三次。然后向每孔加入適當(dāng)濃度溶解于麥芽提取物培養(yǎng)基中的一種物質(zhì)，培養(yǎng)再進(jìn)行24小時(shí)。微孔板用蓋子覆蓋并在30°C、150 rpm孵化24小時(shí)。
2.8.Cellavista設(shè)備
Cellavista是全自動(dòng)細(xì)胞成像儀，具備明場(chǎng)和三個(gè)熒光通道（標(biāo)準(zhǔn)集包括七個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)及相應(yīng)濾波器）。光學(xué)系統(tǒng)由四個(gè)物鏡組成：2x、4x、10x、20x和40x，以及提供4 Mpixel圖像的CCD相機(jī)。Cellavista可評(píng)估6-384微孔板以及培養(yǎng)皿和顯微鏡載玻片。
一系列預(yù)定義應(yīng)用可用（細(xì)胞融合度、懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞核等）。每個(gè)測(cè)定提供相關(guān)的圖像處理算法，由算法評(píng)估的特定對(duì)象類(lèi)型定義。參數(shù)評(píng)估設(shè)置可由用戶(hù)為每個(gè)測(cè)定修改。
對(duì)于圖像獲取，微孔板放入設(shè)備中，可手動(dòng)調(diào)整正確圖像設(shè)置（曝光時(shí)間、光強(qiáng)度、增益、聚焦偏移）。然后掃描所選微孔板孔，圖像自動(dòng)拼接產(chǎn)生整個(gè)孔的圖像。根據(jù)所選測(cè)定和用戶(hù)定義參數(shù)，圖像分析隨后通過(guò)Cellavista評(píng)估算法對(duì)每個(gè)測(cè)定進(jìn)行自動(dòng)一致閾值處理。取決于測(cè)定類(lèi)型，可為圖像分析設(shè)置不同參數(shù)：例如細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞融合度、細(xì)胞或菌落大小和形態(tài)以及熒光應(yīng)用中的熒光強(qiáng)度。設(shè)備還提供模板功能，允許一致評(píng)估相同布局的實(shí)驗(yàn)而無(wú)需手動(dòng)調(diào)整。以二進(jìn)制圖像形式的結(jié)果（評(píng)估對(duì)象高亮）可作為所有圖像的馬賽克查看每個(gè)細(xì)胞（參見(jiàn)圖1，描繪為時(shí)間過(guò)程）。對(duì)于96孔板，每孔可拍攝的最大圖像數(shù)量見(jiàn)表1。
2.9.使用Cellavista設(shè)備評(píng)估藥物效率
為了評(píng)估黃芩素、殼聚糖、地衣酸或兩性霉素B對(duì)酵母生物膜形成不同階段的影響，制備的96孔微孔板每孔用鹽水洗滌三次，然后插入Cellavista自動(dòng)顯微鏡，其中拍攝每孔底部中心二十五張照片（20x物鏡）。這些圖像通過(guò)Cellavista圖像分析軟件評(píng)估，確定參數(shù)：對(duì)比度、最小區(qū)域亮度、強(qiáng)度、靈敏度和大小。天然物質(zhì)或抗生素對(duì)生物膜形成的影響與陰性對(duì)照（無(wú)藥物培養(yǎng)）比較。所有實(shí)驗(yàn)中對(duì)照指定為100%以允許直接比較研究物質(zhì)影響。
2.10.統(tǒng)計(jì)分析
對(duì)照和物質(zhì)對(duì)粘附抑制、生物膜發(fā)展和預(yù)形成生物膜效率差異的顯著性通過(guò)單因素方差分析和Tukey's HSD檢驗(yàn)確定。
3.結(jié)果與討論
3.1.抗真菌活性
生物膜的形成本質(zhì)上與念珠菌屬引起的慢性感染相關(guān)。許多研究已證實(shí)固著細(xì)胞對(duì)大多數(shù)可用抗生素的敏感性降低。因此發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)新的治療劑至關(guān)重要。天然產(chǎn)物能夠干擾生物膜形成的所有階段。它們可以影響環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)、改變細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu)或干擾生物膜形成的調(diào)控系統(tǒng)。所有這些過(guò)程可以干擾細(xì)胞粘附和生物膜形成。由于天然物質(zhì)與生物膜相互作用的機(jī)制復(fù)雜且通常屬特異性，在特定微生物和條件下評(píng)估和描述它們的需求至關(guān)重要。
本研究選擇了已知干擾生物膜形成的天然物質(zhì)。低濃度黃芩素能夠抑制白念珠菌生物膜形成，殼聚糖對(duì)多種微生物表現(xiàn)出抗菌活性，包括白念珠菌生物膜。地衣酸被描述為近平滑念珠菌固著細(xì)胞生長(zhǎng)的有效抑制劑。
它們對(duì)研究近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌菌株的抗真菌活性測(cè)定為最小抑制濃度，顯示在表2中。觀(guān)察到的MICs完全在兩種物種通常觀(guān)察值范圍內(nèi)。
為了評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)固著細(xì)胞的活性，進(jìn)行了一系列濃度范圍的初步實(shí)驗(yàn)，有效濃度結(jié)果顯示在圖2中?；衔镄Ч园俜直龋l形）描繪，相對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)（指定為100%），因此低于100%的值代表細(xì)胞覆蓋區(qū)域降低，超過(guò)100%的值指出物質(zhì)影響增加生物膜覆蓋度的實(shí)例。評(píng)估后選定的二進(jìn)制圖像（黑色區(qū)域代表生物膜）在條形圖下方記錄所有圖中生物膜生物量的排列：物質(zhì)對(duì)粘附的效率（行A）；物質(zhì)對(duì)生物膜發(fā)展的效率（圖像行B）；物質(zhì)對(duì)預(yù)形成生物膜的效率（圖像行C）。
每個(gè)單獨(dú)圖像是拼接圖像集，顯示一個(gè)孔的中心表面——是由Cellavista評(píng)估的25張圖像的編譯。在研究天然化合物中，殼聚糖和黃芩素在低濃度下影響粘附或預(yù)形成生物膜，但地衣酸即使在300μg ml?1濃度下也未表現(xiàn)出足夠的抗生物膜特性，因此被排除其他測(cè)試（單因素方差分析：近平滑念珠菌粘附抑制P=0.67，生物膜發(fā)展P=0.014，預(yù)形成生物膜P=0.15）。生物膜排列在所有對(duì)照實(shí)驗(yàn)中兩種研究微生物中均勻。在大多數(shù)情況下，物質(zhì)影響并均勻降低覆蓋區(qū)域，除黃芩素外，其存在導(dǎo)致簇形成（白圈高亮），即使總覆蓋區(qū)域降低，特別是在近平滑念珠菌生物膜發(fā)展實(shí)驗(yàn)中（行B，第二列）。
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