2.3.最低抑菌濃度（MIC）與棋盤法檢測
MIC assays 如先前描述進行。GIB-C1141144 和 GRI-C1210932的孵育時間延長至48小時，因為這些菌株生長比K56-2慢得多。棋盤格 assays 用抗生素組合進行。當可以確定MIC時（新生霉素、氯新生霉素和妥布霉素），使用在1/32x MIC和MIC值之間以兩倍遞增的濃度。例如，如果某菌株的新生霉素MIC為16μg/mL，則在棋盤格 assay中測試0.5、1、2、4、8和16μg/mL的濃度。無法準確確定PMB和粘菌素對BCC細菌的MIC，因為這些細菌在生長培養(yǎng)基中高于這些化合物的溶解度濃度下生長。所有BCC菌株在1024μg/mL PMB和粘菌素中生長，這是測試的最高濃度。這些被視為所有檢查BCC菌株的MIC的一半。
在棋盤格 assays中，PMB和粘菌素在64（1/32x MIC）、128（1/16x MIC）、256（1/8x MIC）、512（1/4x MIC）和1024μg/mL（1/2x MIC）濃度下測試。分數(shù)抑制濃度指數(shù)（FICI）計算為 FICI = [(A)/MICA] + [(B)/MICB]，其中(A)和(B)是藥物A和B在組合中抑制細菌生長所需的MIC，MICA和MICB是藥物A和B單獨的MIC。FICI ≤0.5被視為協(xié)同作用。對于協(xié)同研究，所有抗生素來自獨立供應商：新生霉素（>90%純）、PMB（>60%純）、粘菌素（>50%純）和妥布霉素（>98%純）購自Sigma（St Louis, MO）。商業(yè)級氯新生霉素由Rhone-Poulenc Santé捐贈。新生霉素和氯新生霉素對實驗BCC菌株組的MIC也使用常規(guī)肉湯稀釋法確定。MIC和棋盤格實驗獨立重復最多四次。在重復之間獲得多個值的情況下，報告較大（更保守）的值。
3.結果
3.1.小分子篩選多粘菌素B協(xié)同劑
圖1.從2686種化合物庫中，5種化合物顯示出與500μg/mL多粘菌素B（PMB）對洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的協(xié)同效應。結果以化合物存在下的生長抑制百分比表示，相對于無化合物時（無論是單獨使用，x軸）或與PMB組合使用（y軸）。黑點代表每種化合物。紅點代表所有未添加庫化合物的孔的結果（每板一孔）。被認為單獨顯著抑制或與PMB協(xié)同的化合物必須抑制生長≥70%（虛線表示，陰影區(qū)域代表更高抑制水平）。點線斜率為1并通過原點；僅用于說明目的。左上象限的點代表在測試濃度下不直接抑制洋蔥伯克霍爾德菌生長但與PMB協(xié)同的化合物。右下象限的點代表抑制洋蔥伯克霍爾德菌但被PMB拮抗的化合物。右上象限靠近線的點代表抑制洋蔥伯克霍爾德菌但不增加或減少PMB效應的化合物?；衔餅椋ˋ）IKD-8344、（B）新生霉素、（C）CL0231、（D）micacocidin B和（E）thielavin B。
在測試濃度（1μg/mL）下，無PMB時，2686種海洋來源化合物中無一對細菌細胞有顯著抑制作用（圖1）。無PMB時的最高抑制為22.8%。在這些條件下，該庫化合物直接抑制洋蔥伯克霍爾德菌菌株K56-2的命中率為0%（0/2686）。這并不排除它們在更高濃度下可能具有直接抗生素活性。如下所述，庫中一種化合物是新生霉素，如果庫濃度為20μg/mL，則會觀察到無PMB時的細菌生長抑制。
篩選揭示了五種化合物能有效增強PMB對洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的抗微生物活性（圖1）。它們各自與PMB的組合在20小時時相對于單獨PMB的生長抑制≥70%。與PMB協(xié)同的化合物命中率為0.2%（5/2686）。這些化合物是thielavin B（圖2A）、micacocidin B（圖2B）、IKD-8344（圖2C）、一種新化合物CL0231（圖2D）和新生霉素（圖2F）。庫中存在三種與micacocidin B結構相似但不與金屬復合的化合物，但它們均無與PMB對洋蔥伯克霍爾德菌的協(xié)同作用。這提供了一個內(nèi)部對照，表明micacocidin B中的金屬是其活性所必需的。一種與CL0231相似的化合物（CL0236；圖2E）其中纈氨酸被苯丙氨酸取代，無與PMB的協(xié)同作用，表明CL0231及相關化合物的生物活性取決于其氨基酸序列。在這五種化合物中，新生霉素和IKD-8344的活性在后續(xù)研究中得到確認（確認率40%；2/5），因為我們無法獲得其他三種化合物的足夠量來重復assays。
圖2.文中討論的化合物的化學結構：（A）thielavin B；（B）micacocidin B；（C）IKD-8344；（D）CL0231；（E）CL0236；（F）新生霉素；和（G）氯新生霉素。結構使用Marvin Sketch v.14.12.8繪制。
3.2.新生霉素和多粘菌素B對其他伯克霍爾德菌分離株的協(xié)同作用
我們評估了新生霉素對洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的協(xié)同效應是否也發(fā)生在其他臨床BCC分離株中，包括多重伯克霍爾德菌菌株C0514和兩株妥布霉素耐藥的BCC分離株（GIB-C1141144和GRI-C1210932）。除了測試PMB，還包括粘菌素和妥布霉素，因為這些抗生素的霧化制劑用于治療CF患者的肺部細菌感染。我們首先確定了這些BCC菌株的個體MIC。它們所有的新生霉素MIC均為16μg/mL，遠低于銅綠假單胞菌PAO1（512μg/mL）和大腸桿菌DH5a（128μg/mL）的值。BCC細菌在測試的最高濃度（1024μg/mL）下生長，用于PMB和粘菌素。最后，BCC分離株GIB-C1141144和GRI-C1210932對妥布霉素的耐藥性顯著高于K56-2或C0514（MIC分別為2048μg/mL和4096μg/mL）。
進行棋盤格assays以量化協(xié)同水平。由于所有BCC細菌對PMB和粘菌素的MIC大于測試的最高濃度（1024μg/mL），我們經(jīng)驗性地將1024μg/mL視為MIC的一半。新生霉素與PMB和粘菌素對測試的BCC菌株均表現(xiàn)出協(xié)同作用（表1）。新生霉素與AMPs對革蘭氏陰性菌的協(xié)同作用先前已有報道。新生霉素略微增強了妥布霉素對K56-2和C0514的活性，但FICI大于0.5（表1）。相反，亞MIC濃度的妥布霉素拮抗了新生霉素對妥布霉素耐藥分離株GIB-C1141144和GRI-C1210932的活性（FICI大于1）。我們推測亞MIC濃度的妥布霉素在這些菌株中激活了一種機制，提供對新生霉素的交叉耐藥性。
由于我們目前無法從海洋來源提取更高濃度的這些化合物，且大多數(shù)化合物缺乏替代來源，無法對初始篩選檢測到的其他協(xié)同化合物進行類似實驗。這些化合物從其生產(chǎn)者生物發(fā)酵、從重組表達系統(tǒng)過量生產(chǎn)或化學合成是未來進一步評估這些化合物的可能選項。
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