討論
從ORR S-3池塘延伸的污染羽流代表了一個(gè)極端的人為污染環(huán)境例子。該站點(diǎn)提供了一個(gè)獨(dú)特的機(jī)會(huì)研究高濃度硝酸鹽和多種金屬對(duì)微生物群落的影響。例如，使用三維電阻率斷層掃描測(cè)量估計(jì)ORR站點(diǎn)主要含硝酸鹽羽流中硝酸鹽濃度高達(dá)50 g/升，并且從羽流內(nèi)污染井直接化學(xué)分析顯示硝酸鹽濃度高達(dá)11.6 g/升（190 mM）。相比之下，其他污染環(huán)境中的硝酸鹽濃度約低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這些包括受農(nóng)業(yè)肥料實(shí)踐影響的Chesterville Branch Watershed,MD（10 mg/升），以及伊朗設(shè)拉子市下的Shiraz沖積含水層，高度污染硝酸鹽來(lái)自農(nóng)業(yè)和工業(yè)活動(dòng)，硝酸鹽濃度高達(dá)149 mg/升。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）對(duì)飲用水中硝酸鹽的最大污染水平（MCL）為10 mg/升。
類似地，在混合物金屬污染方面，ORR站點(diǎn)在金屬數(shù)量
同樣地，在金屬混合物污染方面，ORR場(chǎng)地在金屬數(shù)量和濃度方面具有獨(dú)特性。例如，對(duì)S-3池塘附近受污染井的直接化學(xué)分析顯示，許多金屬的濃度升高，包括鋁（560毫克/升）、錳（170毫克/升）、鈾（140毫克/升）、鎳（9.4毫克/升）、鈷（1.8毫克/升）、鎘（1.1毫克/升）、銅（0.95毫克/升）和鐵（0.55毫克/升）（12）。與其他受污染場(chǎng)地的比較較為困難，因?yàn)閿?shù)據(jù)通常
可用于排放到環(huán)境中的廢水。例如，不銹鋼酸洗產(chǎn)生的冶金廢水含有更高濃度的鐵（133.2毫克/升）和鎳（30.3毫克/升），但這些數(shù)值是在排放到環(huán)境之前（23）。同樣，在酸性礦山排水（AMD）場(chǎng)地，如肯塔基州的派克維爾AMD場(chǎng)地，排放到當(dāng)?shù)叵髑暗膹U水中鐵的濃度（2.88毫克/升）高于ORR羽流中的濃度，但其他金屬如錳（1.25毫克/升）和鋁（0.641毫克/升）的濃度則低得多（28）。在田納西州的寡婦溪AMD場(chǎng)地，進(jìn)水中的鐵濃度（474毫克/升）遠(yuǎn)高于ORR場(chǎng)地，但錳（9.4毫克/升）、鋁（1.8毫克/升）和鎘（0.04毫克/升）的水平則低得多（29）。華盛頓州的米德內(nèi)特礦山是一個(gè)已關(guān)閉的露天鈾礦，水樣中錳（143毫克/升）和鈷（1.6毫克/升）的水平與ORR相似，但鈾（24毫克/升）、鎳（2.7毫克/升）、銅（0.18毫克/升）、鐵（0.18毫克/升）和鎘（0.05毫克/升）的濃度較低（30）。從德國(guó)約翰格奧爾根施塔特的鈾廢料堆中采集的沉積物樣本中，鐵（760毫克/升）和銅（6.6毫克/升）的濃度高于ORR，但鋁（680毫克/升）、鎳（5.0毫克/升）和鈷（2.4毫克/升）的濃度相似，錳（50毫克/升）和鈾（3.0毫克/升）的濃度較低。
本研究中鑒定的七種耐金屬菌株均從ORR地下水或沉積物中分離獲得，所用富集物模擬了污染環(huán)境中的金屬濃度。需要強(qiáng)調(diào)的是，不同金屬可劃分為不同類別，且其化學(xué)性質(zhì)差異顯著。例如，大多數(shù)金屬以可溶性二價(jià)陽(yáng)離子形式存在于中性酸性pH的地下水中，包括Cu2、Cd2、Fe2、Co2、Ni2和Mn2。相比之下，部分金屬如Al3和Fe3為三價(jià)陽(yáng)離子，在中性pH條件下形成不溶性氫氧化物，且在pH低于5.5和3.0的地下水中大多可溶。進(jìn)一步對(duì)比顯示，鈾以可溶性氧陽(yáng)離子二氧化鈾2形式存在，而鉻則以可溶性氧陰離子鉻酸鹽2形式存在。表3展示了這七種新菌株對(duì)不同金屬的敏感性，其中金屬按化學(xué)性質(zhì)分組。在二價(jià)陽(yáng)離子中，所有菌株的EC50值普遍相似，抗性按Cu、Cd、Co、Ni、Mn順序遞增。對(duì)于氧陽(yáng)離子二氧化鈾2，除Castellaniella sp.菌株MT123外，其他菌株均表現(xiàn)出高度抗性，但氧陰離子鉻酸鹽2的EC50值范圍較大。有趣的是，MT123對(duì)氧陽(yáng)離子（二氧化鈾2）和氧陰離子（鉻酸鹽2）高度敏感，但對(duì)毒性更強(qiáng)的二價(jià)陽(yáng)離子Cu2和Cd2的耐受性優(yōu)于大多數(shù)其他菌株。進(jìn)行金屬抗性生長(zhǎng)研究時(shí)，MT123的最佳生長(zhǎng)pH低于其他菌株（pH 5.5對(duì)比pH 6.0至7.0）。在復(fù)雜有機(jī)介質(zhì)中，由于形成不同磷酸鹽、硫酸鹽和氫氧化物離子時(shí)的形態(tài)變化，鈾和鉻的毒性會(huì)隨pH值大幅波動(dòng)。
其中五株菌株來(lái)源于受污染的地下水，但另外兩株——Pantoea sp.菌株MT058和Serratia sp.菌株MT049——分別從未受污染的沉積物和地下水中分離獲得，這表明硝酸鹽和金屬抗性菌株存在于未受污染的環(huán)境中。有趣的是，其中一株菌株MT058對(duì)COMM的抗性排名第二（EC50值為0.7）。MT058的ESV不僅在多個(gè)未受污染的水井中發(fā)現(xiàn)，還在四個(gè)含有超過(guò)5 M鈾的受污染水井中發(fā)現(xiàn)，其中一井含有50 M鈾。
事實(shí)上，我們分離出的七株菌株中有四株（MT049、MT058、MT094和MT0123）的ESV在多個(gè)ORR水井中被發(fā)現(xiàn)，且所有四株菌株均存在于未受污染的水井和至少一個(gè)含有超過(guò)15 M鈾的受污染水井中。因此，即使從未受污染的環(huán)境樣本開(kāi)始，本研究中用于在環(huán)境相關(guān)金屬濃度下富集金屬抗性細(xì)菌的方法也取得了成功。金屬抗性菌株生長(zhǎng)的pH范圍較廣，這與產(chǎn)生ESV匹配的水井pH值相吻合（圖4A）。例如，MT123的pH最適值為5.5，在pH為5.2的地下水井（FW104）中占ESV匹配的7%。同一菌株（MT123）也在其他水井中以較低水平存在。
pH值范圍在3.4至9.8之間。另一方面，兩種Paenibacillus sp.菌株（MT086和MT124）在ORR地下水調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)任何ESV匹配。由于Paenibacillus屬物種是產(chǎn)孢生物，其DNA可能未在16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)中被檢測(cè)到。此外，這兩種菌株是從FW126井中分離的，該井的pH值（3.0）為所有ORR污染井中最低之一，且硝酸鹽和金屬濃度最高（表1）。盡管先前在ORR污染沉積物中已通過(guò)16S rRNA基因序列檢測(cè)到多種Paenibacillus屬物種（34），但此類條件可能促進(jìn)孢子形成和/或使地下水樣本的DNA提取復(fù)雜化。
未來(lái)在ORR進(jìn)行的地下水16S rRNA調(diào)查可受益于使用內(nèi)部孢子對(duì)照來(lái)確定從高度可變的地下水基質(zhì)中提取DNA的效率。本研究的獨(dú)特之處在于，它研究了ORR中的硝酸鹽還原與多金屬抗性相結(jié)合，而非僅關(guān)注單一種或少量金屬的硝酸鹽還原或抗性。一項(xiàng)綜述研究了ORR中硝酸鹽還原菌，并結(jié)合了24項(xiàng)不同研究的微生物群落數(shù)據(jù)。該綜述確定了32個(gè)潛在的硝酸鹽還原屬，這些屬與本研究的分離株有顯著重疊。
事實(shí)上，在研究中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄總RNA擴(kuò)增來(lái)特異性觀察ORR（25,35,36）處的活性微生物群落時(shí)，鑒定出了硝酸鹽還原菌卡斯特拉尼埃拉和潘尼芽孢桿菌。在對(duì)硝酸鹽污染井進(jìn)行乙醇生物刺激實(shí)驗(yàn)時(shí)，還鑒定出一種卡斯特拉尼埃拉菌，這可能對(duì)ORR（37）處的原位硝酸鹽去除具有重要意義。從ORR處污染沉積物中分離出的幾種芽孢桿菌和其他物種隨后被篩選出對(duì)鉛、汞、鉻、鎘和鈾的抗性。然而，本研究與當(dāng)前研究的不同之處在于，這些菌株未在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行表征，且富集過(guò)程未在反映污染環(huán)境的金屬濃度下進(jìn)行。
在我們的研究中，從ORR環(huán)境中分離出七種新的菌株，這些菌株能夠在多種金屬（包括鋁、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鎘和鈾）存在的情況下，通過(guò)還原硝酸鹽獲取生長(zhǎng)所需的能量，這些金屬的濃度接近于ORR污染現(xiàn)場(chǎng)的水平。事實(shí)上，當(dāng)這七株分離菌在有或沒(méi)有COMM金屬混合物的條件下培養(yǎng)時(shí)，其硝酸鹽還原速率相似（圖3）。已知高濃度的多種金屬離子會(huì)破壞氧化還原酶類酶（如硝酸鹽還原酶）和呼吸途徑（如反硝化作用）。例如，在一項(xiàng)關(guān)于鹽沼沉積物中反硝化速率的研究中，報(bào)告指出初始反硝化速率受到幾種金屬（包括鉛、鎳、鉻、鋅、銅、鐵和鎘）在1克/升濃度下的抑制（24）。同樣地，對(duì)模型反硝化生物——假單胞菌RCH2在反硝化條件下進(jìn)行的全基因組適應(yīng)性測(cè)定顯示，當(dāng)在高濃度的幾種不同金屬（包括銅、鋅、鉻和鈾）存在時(shí)，硝酸鹽還原酶和反硝化相關(guān)基因的破壞會(huì)導(dǎo)致該生物在高濃度金屬存在下的適應(yīng)性下降（39,40）。因此，我們分離出的ORR生物體必定具有分子和物理層面的金屬抗性機(jī)制，使它們能夠在極端的ORR環(huán)境中生存，而這些機(jī)制的性質(zhì)目前仍在研究中。
總體而言，S-3池塘周?chē)芟跛猁}和金屬污染的ORR站點(diǎn)是一個(gè)極端環(huán)境，我們從中分離出七種新的硝酸鹽還原細(xì)菌，這些菌株能夠單獨(dú)且同時(shí)耐受多種金屬的組合，包括二價(jià)陽(yáng)離子、三價(jià)陽(yáng)離子、氧陽(yáng)離子和氧陰離子。這些菌株在pH最適值、生長(zhǎng)pH范圍、碳源偏好和金屬耐受程度方面表現(xiàn)出多樣性。其中幾種菌株還通過(guò)16S rRNA基因序列在多種ORR未污染和污染井中被檢測(cè)到。然而，所有菌株在環(huán)境相關(guān)濃度的多種金屬存在下生長(zhǎng)時(shí)，均保持硝酸鹽還原酶活性。未來(lái)對(duì)這些菌株所含金屬耐受分子機(jī)制的研究可能揭示獨(dú)特性質(zhì)，進(jìn)一步增進(jìn)我們對(duì)其他硝酸鹽和金屬污染站點(diǎn)中微生物群落的理解。
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