摘要
能夠生物合成特異性角蛋白酶的角蛋白分解微生物因其在角蛋白廢棄物管理中的潛在應(yīng)用而成為科學(xué)關(guān)注的主題。在幾個細菌類別中，放線菌仍然是角蛋白降解菌株的最重要來源之一，然而微球菌科的成員就其應(yīng)用性角蛋白分解潛力而言很少受到仔細研究。從禽類羽毛廢棄物中分離測試的微球菌屬B1pz被鑒定為藤黃微球菌（M.luteus）。該菌株在含有1-2%雞羽毛和酵母提取物補充劑的培養(yǎng)基中生長，產(chǎn)生32 KU的角蛋白酶和較低水平的蛋白酶（6 PU）。它能夠有效分解羽毛或表皮角質(zhì)層的"軟"角蛋白，而其他"硬"毛發(fā)型角蛋白則不然。產(chǎn)生的角蛋白分解酶主要是堿性絲氨酸或硫醇蛋白酶的混合物，在最適pH 9.4、55°C下具有活性。在粗培養(yǎng)液中鑒定出四種主要的蛋白酶組分，分子量分別為62、185、139和229 kDa。對還原因子輔助作用的研究表明，還原性硫化合物可用于在角蛋白的酶消化過程中增強角蛋白分解，而不是在培養(yǎng)條件下。所展示的藤黃微球菌分離株表現(xiàn)出顯著的角蛋白分解潛力，這決定了其在禽類副產(chǎn)品生物降解或角蛋白基飼料成分配制方面的可行應(yīng)用能力。
引言
積累角蛋白廢棄物的全球性問題（主要是作為屠宰場副產(chǎn)品）引發(fā)了對涉及多種角蛋白分解微生物的生物利用手段的科學(xué)興趣。這種方法為當(dāng)前采用的涉及高能耗技術(shù)或有毒試劑的生物轉(zhuǎn)化方法提供了一種建設(shè)性替代方案。許多報告涉及放線菌角蛋白分解酶的主題，然而，絕大多數(shù)集中在鏈霉菌科成員，其中鏈霉菌屬仍然是大量角蛋白酶生產(chǎn)者的無限來源。盡管如此，已知幾種不太常見的放線菌表現(xiàn)出顯著的角蛋白分解潛力。Thys等人描述的短小桿菌屬（Microbacterium sp.）kr10，在以羽毛粉作為唯一營養(yǎng)源的情況下生長，據(jù)報道能在嗜溫溫度下產(chǎn)生角蛋白分解蛋白酶。一項詳細調(diào)查揭示了一種42 kDa、含Zn2?、Mg2?的金屬蛋白酶，對酪蛋白、白蛋白和角蛋白具有最高特異性。純化的角蛋白酶在2-巰基乙酸鹽存在下能有效水解天然角蛋白。如Mitsuiki等人所示，嗜堿的Nocardiopsis sp.TOA-1在脫脂牛奶/酵母提取物培養(yǎng)基上生長，生物合成了一種高度穩(wěn)定的角蛋白分解酶，其最適活性在pH 11.0-11.5和70-75°C溫度下。這種20 kDa的絲氨酸蛋白酶對角蛋白表現(xiàn)出高特異性活性，對酪蛋白的活性較低。
從幾個禽類養(yǎng)殖場來源的篩選放線菌中，Saha等人獲得了一種羽毛降解的Nocardiopsis sp.SD5，能夠在高度堿性條件下，在淀粉/酪蛋白培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天內(nèi)，有效利用角蛋白（45-50°C）。粗角蛋白酶提取物對天然羽毛顯示出巨大的活性。酶譜分析揭示了30 kDa和60 kDa兩種蛋白水解組分的存在。也有關(guān)于新型角蛋白分解放線菌屬于Amycolatopsis或Actinomadura屬的報告。普遍存在的微球菌屬細菌是已知的細胞外絲氨酸或硫醇蛋白酶以及彈性蛋白酶的生產(chǎn)者。
然而，微球菌細菌的真正角蛋白分解潛力很少被提及和被低估。雖然一些致病菌株負責(zé)某些皮膚感染，但其他菌株可以作為角蛋白分解酶的寶貴來源或有助于角蛋白廢棄物管理。密切相關(guān)的玫瑰色庫克菌（Kocuria rosea）經(jīng)Bernal等人深入研究，是羽毛誘導(dǎo)角蛋白酶的杰出生產(chǎn)者的例子。該菌株在含有3%羽毛的批次培養(yǎng)物中，在補充了酵母提取物的優(yōu)化礦物質(zhì)培養(yǎng)基中，于40°C下生物合成角蛋白分解和酪蛋白分解蛋白酶。玫瑰色庫克菌的獨特特性使作者能夠設(shè)計一個發(fā)酵過程，以提高廢棄羽毛的生物價值，用作動物飼料成分。
角蛋白的微生物分解已知不僅由特定的蛋白水解酶進行，還涉及負責(zé)底物中二硫鍵斷裂的還原因子。硫化合物如亞硫酸鹽或硫化物，以及二硫鍵還原酶，已知是此過程的一部分（Yamamura et al.，2002;Prakash et al.，2010;Cedrola et al.，2012）。因此，研究微生物生長環(huán)境中還原因子的存在，以及補充二硫鍵還原劑在改善角蛋白分解中的可行性變得至關(guān)重要。
本研究旨在通過評估角蛋白酶生產(chǎn)條件、角蛋白生物降解能力、粗培養(yǎng)液中蛋白酶和角蛋白酶的初步表征，以及研究還原因子在角蛋白分解增強中的作用，來評估微球菌屬B1pz細菌的角蛋白分解潛力。
材料與方法
細菌菌株和分子系統(tǒng)發(fā)育研究
該細菌菌株在先前的研究中從波蘭弗羅茨瓦夫附近的家禽加工廠的羽毛廢棄物中分離，并保藏于波蘭弗羅茨瓦夫環(huán)境與生命科學(xué)大學(xué)生物技術(shù)與食品微生物學(xué)系的本地菌種保藏中心。從營養(yǎng)肉湯（葡萄糖10 g/L；營養(yǎng)肉湯8 g/L）的24小時液體培養(yǎng)物中，使用GeneMATRIX細菌和酵母基因組DNA純化試劑盒（Eurx）提取基因組DNA。使用以下通用引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增16S rRNA基因：（27 F）AGAGTTTGATCGTGGCTCAG和（1492L R）GGTTACCTTGTTACGACT。PCR反應(yīng)混合物（50μL）包含：25μL Taq PCR Master Mix（2x）（Eurx）；每種引物20 pmol和基因組DNA 1mu g。
PCR程序包括：94°C初始變性5分鐘，隨后進行35個循環(huán)：94°C變性1分鐘，53°C退火30秒，72°C延伸90秒，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物從反應(yīng)組分中純化，并使用引物：27 F、1492L R和一個額外的內(nèi)部引物CTCCTACGGGAGGCAGCAG（357 F）進行測序。獲得的序列提交至核糖體數(shù)據(jù)庫項目（RDP）第10版。使用MAFT版本6和Archaeopteryx版本0.972+進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育研究。
角蛋白材料
實驗中使用的角蛋白是各種皮膚附屬物，如白雞羽毛、白鴕鳥羽毛的羽枝和羽軸、豬鬃、羔羊毛、人發(fā)和表皮角質(zhì)層（s.c.）。底物通過用甲醇-氯仿溶液（1:1）洗滌和脫脂制備。
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