摘要
芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae已被證明是衰老研究領(lǐng)域中的重要模式生物。復(fù)制性壽命和時(shí)序壽命是用于研究酵母衰老的兩個(gè)既定范式。復(fù)制性衰老定義為單個(gè)酵母母細(xì)胞在衰老前產(chǎn)生的子細(xì)胞數(shù)量；時(shí)序衰老定義為細(xì)胞在非分裂、類靜止?fàn)顟B(tài)下能夠存活的時(shí)間長(zhǎng)度。我們開(kāi)發(fā)了一種用于定量測(cè)量時(shí)序壽命的高通量方法。該方法包括在恒定溫度下，在確定的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)細(xì)胞使其衰老。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從衰老培養(yǎng)物中取出一部分細(xì)胞，接種到豐富的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然后使用Bioscreen C MBR機(jī)器獲取這部分老化細(xì)胞的高分辨率生長(zhǎng)曲線。隨后應(yīng)用一種算法，根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)確定每個(gè)亞群中活細(xì)胞的相對(duì)比例。與其他時(shí)序壽命測(cè)定方法相比，該方法所需的時(shí)間和資源顯著減少，同時(shí)保持了可重復(fù)性和精確性。這種檢測(cè)方法的高通量性質(zhì)應(yīng)允許進(jìn)行大規(guī)模的遺傳和化學(xué)篩選，以識(shí)別新的長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)因子，以便在更復(fù)雜的生物體中進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。
第1部分：衰老培養(yǎng)物的制備
1.將感興趣的菌株從冷凍儲(chǔ)備液中劃線接種到Y(jié)EPD瓊脂平板（1%酵母提取物，2%細(xì)菌蛋白胨，2%瓊脂，2%葡萄糖）上。
2.在30°C下培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)或直到單菌落出現(xiàn)。
3.挑取單菌落并接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%細(xì)菌蛋白胨，2%葡萄糖）的試管中。
4.在30°C下培養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)使用搖床或滾軸鼓保持恒定振蕩。
5.用50μL過(guò)夜培養(yǎng)物接種5 mL合成完全（SC）培養(yǎng)基（表1）。通常為每個(gè)菌株制備三個(gè)SC培養(yǎng)物，以便為每個(gè)待檢菌株的壽命分析提供三次生物學(xué)重復(fù)。
6.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間（通常為2周或更長(zhǎng)時(shí)間），將培養(yǎng)物置于30°C，并在滾軸鼓上保持恒定振蕩。
第2部分：獲取存活率時(shí)間點(diǎn)
在SC培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后，細(xì)胞應(yīng)進(jìn)入穩(wěn)定期，可以獲取第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)。隨后的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)每2-3天獲取一次，至少持續(xù)兩周。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)：
1.準(zhǔn)備用于接種的Bioscreen 100孔蜂窩板，每個(gè)孔中加入145μL YEPD。確保至少留一個(gè)孔只加YEPD而不接種細(xì)胞，以備后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
2.從培養(yǎng)箱中取出衰老培養(yǎng)物。
3.短暫渦旋第一個(gè)要接種到蜂窩板中的培養(yǎng)物，注意不要濺出任何培養(yǎng)液。
4.取出5μL混合均勻的培養(yǎng)物，將其移液到蜂窩板的第一個(gè)孔中。在取出5μL等分樣品前后，對(duì)每個(gè)試管的管口進(jìn)行火焰消毒。
5.對(duì)每個(gè)衰老培養(yǎng)物重復(fù)此過(guò)程，務(wù)必記下每個(gè)培養(yǎng)物對(duì)應(yīng)的孔位置。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)后續(xù)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)使用相同的孔位置。
6.接種完成后，將培養(yǎng)物放回30°C培養(yǎng)箱。
第3部分：加載Bioscreen C MBR生長(zhǎng)曲線分析儀
1.抬起蓋子露出培養(yǎng)室，取下樣品盤(pán)蓋。
2.將新接種的蜂窩板插入樣品盤(pán)（如果只讀取一個(gè)板，請(qǐng)使用左側(cè)插槽）。
3.蓋回樣品盤(pán)蓋，放下培養(yǎng)室蓋。
4.檢查確保熱傳遞液高于最低填充液位。如果液位低，請(qǐng)使用提供的熱傳遞液和1000mu L移液器添加更多液體。
5.使用Bioscreen軟件"EZExperiment"，設(shè)置以下參數(shù)以獲得適合釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線：
樣品數(shù)量：輸入含有培養(yǎng)基的孔數(shù)或200
濾光片：420-580nm，寬帶
溫度：30°C
實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)：1天，0小時(shí)，0秒
測(cè)量間隔：30分鐘
振蕩：開(kāi)啟，連續(xù)振蕩，高速
6.點(diǎn)擊"開(kāi)始"開(kāi)始讀數(shù)。
第4部分：數(shù)據(jù)分析
通常，在兩周內(nèi)獲取六個(gè)時(shí)間點(diǎn)。時(shí)間點(diǎn)分別在第2、4、6、9、11和13天獲取。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和測(cè)試的菌株，可能需要更頻繁或更不頻繁地獲取時(shí)間點(diǎn)，或者超過(guò)2周。重要的是，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都以相同的順序加載蜂窩板，使得每個(gè)衰老培養(yǎng)物在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都對(duì)應(yīng)相同的孔位置，這將使數(shù)據(jù)分析更加容易。
1.從Bioscreen C MBR機(jī)器獲取輸出文件。軟件"EZExperiment"將輸出Bioscreen數(shù)據(jù)為制表符分隔的文件，該文件與Microsoft Excel以及其他軟件兼容。第一列顯示實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行OD測(cè)量的時(shí)間，隨后的列代表Bioscreen蜂窩板中的每個(gè)孔（圖1）。
圖1.Bioscreen程序"EZExperiment"的數(shù)據(jù)輸出。A列顯示進(jìn)行吸光度讀數(shù)的時(shí)間。后續(xù)列代表接種了來(lái)自衰老培養(yǎng)物的細(xì)胞的蜂窩板各孔
2.刪除每列的第一個(gè)OD讀數(shù)。該讀數(shù)是"噪音"。
3.通過(guò)從每列的所有OD值中減去僅含YEPD的孔的OD值來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。這可以去除培養(yǎng)基的背景吸光度。
4.繪制生長(zhǎng)曲線。曲線將隨年齡發(fā)生移動(dòng)（圖2）。例如，通過(guò)繪制第1列（蜂窩板第1孔）在六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線，可以觀察到曲線隨時(shí)間明顯向右移動(dòng)。
5.根據(jù)第2天時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)計(jì)算每個(gè)孔的倍增時(shí)間(delta)。用于計(jì)算倍增時(shí)間的方程為：
其中OD_{1}和OD_{2}代表連續(xù)的OD測(cè)量值，t_{1}和t_{2}是測(cè)量間隔時(shí)間。僅計(jì)算OD值在0.2到0.5之間的倍增時(shí)間。這些值的平均值即為該孔的倍增時(shí)間。僅計(jì)算OD值在0.2到0.5之間的倍增時(shí)間。這些值的平均值即為該孔的倍增時(shí)間。大多數(shù)野生型酵母菌株的倍增時(shí)間值應(yīng)在85到90分鐘之間。
6.對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，計(jì)算生長(zhǎng)曲線相對(duì)于初始時(shí)間點(diǎn)（第2天）的時(shí)間偏移(Delta t)。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是確定每個(gè)孔在初始時(shí)間點(diǎn)和每個(gè)后續(xù)時(shí)間點(diǎn)之間達(dá)到OD 0.3所需時(shí)間的差異。特定孔達(dá)到OD 0.3的時(shí)間可以根據(jù)對(duì)應(yīng)于ln(OD)隨時(shí)間變化的線性回歸方程計(jì)算，該方程基于OD=0.3兩側(cè)的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
7.計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的存活分?jǐn)?shù)以生成生存曲線（圖3）。將初始時(shí)間點(diǎn)（第2天）定義為100%存活率。對(duì)于每個(gè)后續(xù)時(shí)間點(diǎn)，使用以下方程計(jì)算存活百分比：
圖3.A)使用圖1的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)生成的生存曲線。第2天時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為100%活力點(diǎn)。B)同一實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的兩個(gè)菌株的最終生存曲線。這些生存曲線代表每個(gè)菌株三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均活力。誤差棒代表生物學(xué)重復(fù)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)差。生存曲線下的陰影區(qū)域代表菌株1的生存積分（SI）。
圖2.單個(gè)生物學(xué)重復(fù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的生長(zhǎng)曲線。隨著衰老培養(yǎng)物中的細(xì)胞失去活力，曲線隨時(shí)間發(fā)生明顯移動(dòng)。初始時(shí)間點(diǎn)（第2天）與后續(xù)時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間長(zhǎng)度決定了該特定年齡的活力。
其中s_{n}是存活百分比，Delta t_{n}是時(shí)間偏移，delta_{n}是倍增時(shí)間。
8.根據(jù)需要為每個(gè)孔（或重復(fù)孔）生成生存曲線（圖3B），通過(guò)繪制活細(xì)胞分?jǐn)?shù)（或百分比）隨年齡變化的圖。
9.計(jì)算每個(gè)孔的生存積分（SI）。SI定義為生存曲線下的面積，可以通過(guò)以下公式估算：
10.根據(jù)SI和存活數(shù)據(jù)確定重復(fù)孔的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。常見(jiàn)的關(guān)注統(tǒng)計(jì)參數(shù)包括每組生物學(xué)重復(fù)的平均值、中位數(shù)和方差?？梢允褂胻檢驗(yàn)或類似分析對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的SI進(jìn)行成對(duì)比較。也可能需要如4.8所述，從平均的生物學(xué)重復(fù)生成生存曲線。
第5部分：代表性結(jié)果
實(shí)驗(yàn)完成后，您將繪制出生存曲線并進(jìn)行足夠的數(shù)據(jù)分析，以確定幾種不同菌株或條件下的時(shí)序衰老潛力。如果操作正確，從Bioscreen C MBR機(jī)器獲得的生長(zhǎng)曲線應(yīng)類似于圖2所示，生成的生存曲線應(yīng)類似于圖3所示。通常，在此所述條件下培養(yǎng)的野生型細(xì)胞的中位時(shí)序壽命約為7天。在不同菌株和某些條件下觀察到存活率存在顯著差異，例如在0.05%葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，中位存活時(shí)間可超過(guò)30天。
注：此配方適用于二倍體BY4743菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。應(yīng)在合成完全培養(yǎng)基中添加5倍終濃度以補(bǔ)償氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
討論
本文描述的高通量時(shí)序壽命測(cè)定法是一種有效的方法，可用于以高精度和準(zhǔn)確度量化大量菌株的衰老潛力。與通過(guò)計(jì)數(shù)菌落形成單位來(lái)確定存活率的經(jīng)典方法相比，該方法的主要進(jìn)步在于使用搖床/培養(yǎng)箱/讀板設(shè)備（如Bioscreen C MBR機(jī)器）來(lái)獲取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高分辨率生長(zhǎng)曲線。與低通量時(shí)序壽命測(cè)定法的直接比較表明，該方法實(shí)現(xiàn)了相當(dāng)（或更好）的精度，同時(shí)顯著增加了可分析的樣品數(shù)量。該方法的主要進(jìn)步在于使用搖床/培養(yǎng)箱/讀板設(shè)備（如Bioscreen C MBR機(jī)器）來(lái)獲取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高分辨率生長(zhǎng)曲線。與低通量時(shí)序壽命測(cè)定法的直接比較表明，該方法實(shí)現(xiàn)了相當(dāng)（或更好）的精度，同時(shí)顯著增加了可分析的樣品數(shù)量，適用于衰老研究。然而，該方法可以很容易地適應(yīng)替代的培養(yǎng)條件，例如預(yù)適應(yīng)到每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高分辨率生長(zhǎng)曲線。與低通量時(shí)序壽命測(cè)定法的直接比較表明，該方法實(shí)現(xiàn)了相當(dāng)（或更好）的精度，同時(shí)也可以設(shè)想用于藥理學(xué)篩選目的，例如將來(lái)自化合物庫(kù)的不同化學(xué)化合物添加到衰老培養(yǎng)基中，而不是接種不同的菌株。
這里描述的方法還為壽命確定所使用的時(shí)間點(diǎn)提供了靈活性。如上所述，在實(shí)驗(yàn)的第2、4、6、9、11和13天獲取時(shí)間點(diǎn)。這些時(shí)間點(diǎn)適用于篩選酵母ORF缺失庫(kù)以尋找壽命改變的突變體，但可能不適用于其他應(yīng)用、培養(yǎng)條件或遺傳背景。但應(yīng)注意，如果希望跨多個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，則每個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用相同的一組時(shí)間點(diǎn)。
在進(jìn)行時(shí)序壽命實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，我們注意到衰老培養(yǎng)物中的一部分細(xì)胞會(huì)周期性地重新進(jìn)入細(xì)胞周期，這種現(xiàn)象稱為"喘息"。喘息可以觀察到一個(gè)或多個(gè)較晚時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)曲線向左移動(dòng)，對(duì)應(yīng)于衰老培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)量的增加。除非活力已經(jīng)足夠低，以至于后續(xù)時(shí)間點(diǎn)不會(huì)顯著影響SI，否則發(fā)生喘息的培養(yǎng)物應(yīng)從分析中剔除。
Bioscreen C MBR機(jī)器的日常維護(hù)對(duì)于獲得可重復(fù)且準(zhǔn)確的壽命數(shù)據(jù)是必要的。必須保持熱傳遞液高于最低填充液位，并且應(yīng)在每次運(yùn)行機(jī)器前進(jìn)行檢查。定期擦拭培養(yǎng)室內(nèi)部以去除由蜂窩板連續(xù)振蕩產(chǎn)生的灰塵也是有益的。燈泡也需要每年更換一到兩次。F1.b2錯(cuò)誤消息表示燈泡光線不足。最好手頭備有幾個(gè)備用燈泡。
在過(guò)去幾年中，識(shí)別改變簡(jiǎn)單真核生物壽命的突變體和化學(xué)物質(zhì)一直是衰老研究的驅(qū)動(dòng)力。特別令人感興趣的是那些能減緩進(jìn)化上不同物種衰老的干預(yù)措施。本文描述的時(shí)序壽命方法促進(jìn)了對(duì)芽殖酵母基本衰老機(jī)制的理解，并識(shí)別了新的長(zhǎng)壽因子，這些因子最終可能被證明可作為治療人類年齡相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。
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