評估抗真菌化合物PTS對黃曲霉的有效性
制備含PTS的培養(yǎng)基
在評估PTS抗真菌化合物時，培養(yǎng)基如上所述制備。水用甘油修改至所需aw水平（0.995和0.95）。完全冷卻至室溫（25°C）后，在無菌條件下添加適量PTS儲備溶液以獲得18種不同濃度。之后，培養(yǎng)基使用多通道移液器倒入100孔微孔板。
平行實驗在9厘米平皿中進行，使用含2%w/v瓊脂的固體瓊脂培養(yǎng)基。在這種情況下，為減少實驗長度，僅制備九種濃度加對照。當培養(yǎng)基約40°C時，添加適量PTS儲備溶液。熔融培養(yǎng)基劇烈搖動后倒入9厘米平皿。
在兩種情況下，通過添加適當體積的80%乙醇（EtOH）水溶液（v/v）進行對照實驗，含所有PTS加標培養(yǎng)基，給出培養(yǎng)基中最終EtOH濃度0.5%（v/v）。
實驗技術和數(shù)據(jù)收集
制備不同aw水平的半固體YES培養(yǎng)基（0.125%瓊脂）儲備。完全冷卻后，20毫升培養(yǎng)基無菌轉移至無菌螺旋蓋塑料容器。添加先前制備的不同PTS在80%乙醇水溶液工作標準適量至每個塑料容器，以獲得18種不同濃度范圍5至100 ppm，內(nèi)容物搖動。
含PTS的培養(yǎng)基接種200μl含1x10^5孢子/毫升的黃曲霉孢子懸浮液?；旌衔飺u動后倒入無菌平皿，然后使用多通道移液器轉移至100孔板。每孔加載300μl，每種濃度使用五個重復孔。不含接種物但含目標乙醇量的培養(yǎng)基作為空白，一旦接種后用作對照。板加載到Bioscreen C中，培養(yǎng)7天，O.D.在600納米自動每20分鐘記錄。
使用原始數(shù)據(jù)生成O.D./時間圖，使用Microsoft®Excel®和Sigma Plot v.10.0（Systat Software Inc.，豪恩斯洛，倫敦，英國）。
MIC、NIC和MIC50%（MIC50）計算
LPM（Lambert&Pearson，2000）（方程（1））使用非線性回歸擬合，最小化平方和作為搜索標準。分析使用JMP統(tǒng)計軟件包（SAS Institute，卡里，NC，美國）進行。MIC和NIC分別使用方程（2）和（3）計算。MIC50使用方程（4）計算。該方程通過解濃度（x）在方程（1）中當P0=（P0/2）時獲得。
該值的優(yōu)勢在于它考慮了劑量響應（斜率參數(shù)），而其他僅基于MIC的測量則沒有。
使用菌絲菌落延伸計算LD50和LD90
使用含1.0x10^6孢子/毫升的孢子懸浮液在0.05%Tween 80鹽溶液中，在無菌條件下接種平皿中心。菌絲延伸速率測量超過7天。生長滯后期視為達到5毫米直徑菌落的時間（天）。每種處理制備五個平皿，菌落直徑在培養(yǎng)期間在兩個垂直方向測量。兩個直徑之和除以4獲得半徑。這些半徑測量然后平均超過使用的重復數(shù)。使用Baranyi生長模型（Baranyi等人，1993；Baranyi&Roberts，1994）分析數(shù)據(jù)，最小化滯后期（λ，小時）和最大比生長速率（μm，毫米/天）計算的主觀性。計算LD50和LD90值以比較生長速率與對照處理。
結果
培養(yǎng)基瓊脂含量優(yōu)化
當使用固體培養(yǎng)基（0.5-2%瓊脂w/v）時，表面接種和針接種孢子懸浮液到培養(yǎng)基中導致真菌生長。然而，從Bioscreen獲得的O.D.時間^-1曲線給出高變異性。重復孔之間和不同重復實驗之間的變異性高（數(shù)據(jù)未顯示）。液體培養(yǎng)基提供良好生長產(chǎn)量和較少變異性，但重復孔和重復實驗之間仍有顯著差異。
最佳結果使用半固體培養(yǎng)基獲得。使用的瓊脂含量范圍從0.1%到0.2%瓊脂w/v。圖2顯示在YES培養(yǎng)基中含0.125%和0.2%瓊脂w/v的十個重復孔生長黃曲霉菌落從孢子接種物的結果。這表明當使用較低瓊脂濃度時，孔間重現(xiàn)性更好。因此，選擇0.125%w/v瓊脂作為最佳選項。不同日期的重復實驗給出可重現(xiàn)和一致的結果。
接種物大小優(yōu)化
圖3顯示在YES培養(yǎng)基中接種不同孢子濃度（10^2-10^6孢子/毫升）后獲得的平均O.D./時間曲線（十個個體曲線）。為研究重復間變異性，獲得曲線平均的均方根誤差（RMSE）。結果表明較低孢子負載導致較高曲線分散（RMSE；1x10^2孢子/毫升=0.357；1x10^3孢子/毫升=0.286），而當使用較高濃度時分散較小（RMSE；1x10^5孢子/毫升=0.118；1x10^6孢子/毫升=0.151）。非常高濃度孢子產(chǎn)生初始O.D.輕微增加?；谶@些結果，選擇最終接種物1x10^5孢子/毫升用于所有后續(xù)實驗。
孔體積優(yōu)化
檢查不同體積YES培養(yǎng)基含10^5孢子/毫升黃曲霉以確定最佳使用體積。鑒于最大孔體積為500μl，測試體積為200、250、300、350和400μl。平均生長曲線（每種處理十個重復）顯示盡管使用最高體積是最低量的兩倍，曲線非常相似（圖4）。此外，不同平均曲線RMSE值之間未發(fā)現(xiàn)差異，范圍從0.097到0.132。
不同O.D.值下真菌生物量比較
微孔板含50孔加載400μl YES接種1x10^6和1x10^4孢子/毫升黃曲霉，培養(yǎng)后每小時后計算生物量，初始培養(yǎng)13小時后。兩種濃度生物量對O.D.讀數(shù)結果如圖5所示。通常，生物量隨O.D.增加而增加。當兩種初始濃度達到相似O.D.讀數(shù)時，獲得的生物量幾乎相同，表明O.D.和生物量之間直接關系。
不同環(huán)境條件下PTS效果
在不同環(huán)境條件下，使用八種不同濃度PTS獲得的平均生長曲線如圖6所示。使用Microsoft®Excel®模板獲得所有環(huán)境條件下O.D.為0.2的TTD，該模板使用連續(xù)O.D.讀數(shù)之間的線性插值預測O.D.=0.2時的TTD。這些數(shù)據(jù)使用LPM（方程（1））分析。計算模型參數(shù)和95%置信區(qū)間。獲得值如表1所示。
盡管觀察到Po值差異（表明不同環(huán)境對在沒有抑制劑情況下達到O.D.=0.2所需時間的影響），參數(shù)P1和P2在統(tǒng)計上無差異（P>0.05）。這表明盡管獲得的菌絲量不同（20°C vs 25°C和aw 0.995 vs 0.95），PTS的效果在不同條件下保持相同。PTS的效果在此短范圍內(nèi)獨立于溫度和aw。
MIC、NIC和MIC50計算及與LD50值和視覺觀察比較
使用前一節(jié)獲得的參數(shù)，根據(jù)方程（2）-（4）計算MIC、NIC和MIC50，及其95%置信限。LD50值通過比較使用Baranyi模型獲得的生長速率計算。所有數(shù)據(jù)比較如表2所示。計算的所有四種環(huán)境條件的NIC、MIC和MIC50在統(tǒng)計上無差異（P>0.05）。這些相似性顯示PTS的有效性獨立于這些環(huán)境條件。
在模型中，Po取決于環(huán)境條件，除了PTS。此外，作為環(huán)境因素獨立性的證明，相對RTD對PTS濃度的表示已繪制（圖7）。這顯示所有數(shù)據(jù)落在同一線上，證明真菌行為對相同PTS濃度相似。7天后，MIC值準確預測在YES平皿中50 ppm PTS下未觀察到生長。
與LD50值相比，獲得的MIC50濃度始終小于使用基于延伸速率的傳統(tǒng)方法計算的值。而LD50值，比較菌落生長速率，范圍從40到45 ppm，MIC50值，基于比較菌絲生物量，范圍從32到34 ppm。部分原因可能在于MIC50使用計算的劑量響應，而LD50計算缺少這一點。
表1：LPM參數(shù)和95%置信限。
表2：PTS濃度值的MIC、NIC和MIC50及其95%置信限和LD50值。
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