使用質粒pJL84構建針對fruA(PfruA-cat)、levD(PlevD-cat)和manL(PmanL-cat)啟動子的CAT報告基因融合，方法是將包含啟動子的DNA片段（包括同源核糖體結合位點）插入到缺乏核糖體結合位點的金黃色葡萄球菌無啟動子cat基因前面。通過SphI和SacI限制性酶切釋放啟動子-cat融合片段，并亞克隆到整合載體pMJB8中，該載體允許將DNA插入片段以單拷貝形式遞送到戈登氏鏈球菌染色體上的gtfG基因中。所有基因融合在轉化戈登氏鏈球菌前均通過DNA測序確認，并通過PCR確認所得分離株中整合盒的正確構型。
生化測定。細菌培養(yǎng)物在補充了各種碳水化合物的30 ml TV基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)中期，通過離心收集細胞，用相同體積的10 mM Tris緩沖液(pH 7.8)洗滌一次，重懸于750μl相同緩沖液中，然后在Bead Beater(Biospec Products,Bartlesville,OK)中均質化30秒，兩次，間隔冰上2分鐘。在4°C下以18,000 x g離心10分鐘后，回收上清液用于通過Shaw的方法測量CAT活性。裂解液的蛋白質濃度通過Bradford(Bio-Rad)或二辛可寧酸(BCA;Thermo Scientific)測定法確定。CAT活性表示為每分鐘每毫克蛋白質乙酰化的氯霉素納摩爾數(shù)。
PEP依賴性PTS測定根據(jù)別處描述的方案進行，略有修改。簡言之，在含有0.5%指定碳水化合物的TV基礎培養(yǎng)基中厭氧生長的30 ml培養(yǎng)物在指數(shù)晚期（600 nm光密度[OD600]=0.5至0.6）收獲，用30 ml含有5 mM MgCl2的100 mM Na-K-PO4緩沖液(pH 7.2)洗滌兩次，重懸于1 ml相同緩沖液中，然后通過渦旋振蕩與50μl甲苯-丙酮(1:9,體積比)處理2分鐘（兩次，間隔冰上2分鐘）進行透化處理。在這些測定中使用厭氧生長的細胞，因為存在氧的情況下生長的細胞具有高水平的NADH自發(fā)氧化，干擾測定，這顯然與NADH氧化酶的誘導有關。然后對透化細胞進行PTS測定。使用BCA測定法測量樣品的蛋白質濃度，PTS活性以PEP依賴性方式表示為每分鐘每毫克蛋白質氧化的NADH納摩爾數(shù)。
結果
戈登氏鏈球菌中fruA、levD和manL同源物的鑒定。為了在戈登氏鏈球菌DL1株的基因組中找到同源的外切-β-D-果糖苷酶(fruA)基因，使用變形鏈球菌的fruA蛋白序列(SMU.78;GenBank基因座標簽)在http://www.oralgen.lanl.gov對戈登氏鏈球菌Challis基因組序列進行BLAST搜索。鑒定出一個同源的開放閱讀框(ORF)SGO_0385(Oralgen基因ID)，也注釋為外切-β-D-果糖苷酶。預測戈登氏鏈球菌的fruA基因編碼一個1408個氨基酸殘基的多肽，與血鏈球菌、變形鏈球菌和唾液鏈球菌的β-果糖苷酶分別具有95%、58%和56%的同一性。BLAST搜索中鑒定出的第二個最相近的基因產(chǎn)物是蔗糖-6-磷酸水解酶(SGO_1302)。為了驗證fruA作為果糖苷酶的功能，通過等位基因交換用非極性紅霉素抗性決定簇(em)構建了fruA突變體，并在含有0.05%葡萄糖和0.5%β2,1-連接的果糖同聚物菊粉的TV培養(yǎng)基中測試其生長。雖然野生型菌株正常生長，呈現(xiàn)典型的二次生長曲線，但fruA突變體在葡萄糖耗盡后停止生長（圖1）。因此，該現(xiàn)象表明戈登氏鏈球菌的fruA基因編碼功能性果聚糖水解酶。額外的測試證實fruA突變體在利用葡萄糖方面沒有缺陷，并且如果菊粉是培養(yǎng)基中唯一的碳水化合物來源則完全不能生長（數(shù)據(jù)未顯示）。
類似地，使用變形鏈球菌的果糖/甘露糖特異性酶IIA組分(levD,SMU.1961c)的蛋白序列對戈登氏鏈球菌基因組序列進行BLAST搜索。鑒定出一個ORF，SGO_1893，注釋為PTS系統(tǒng)的果糖（甘露糖）特異性IIA組分，是編碼IIA組分(levD)以及果糖/甘露糖型滲透酶的IIB、IIC和IID結構域（分別由levE、levF和levG編碼）的四基因操縱子中的第一個基因。預測levD基因編碼一個145個氨基酸的多肽，與血鏈球菌、變形鏈球菌和乳房鏈球菌的果糖PTS IIA組分分別具有80%、68%和53%的同一性。同時還鑒定出一個葡萄糖/甘露糖特異性PTS IIAB組分(SGO_1679)，命名為manL。預測戈登氏鏈球菌的manL基因編碼一個329個氨基酸殘基的多肽，與肺炎鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌和變形鏈球菌的IIABMan基因分別具有94%、91%、87%和83%的同一性，并且是編碼EIIMan滲透酶的IIC和IID組分的明顯操縱子的一部分。
戈登氏鏈球菌manL和levD突變體的表征。為了評估m(xù)anL和levD在戈登氏鏈球菌中的功能，使用非極性em盒在DL1株背景下構建了等位基因替換突變體。為了確定manL和levD在碳水化合物轉運中的作用，使用Bioscreen C監(jiān)測了野生型菌株以及manL和levD突變體在補充了0.2%葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖的TV培養(yǎng)基中的生長。與野生型菌株相比，manL突變體在葡萄糖和甘露糖中的生長速率較慢，在半乳糖中顯著減慢，但在果糖上僅略微減慢（表1），表明ManL可能參與戈登氏鏈球菌對葡萄糖、甘露糖和半乳糖的攝取。相反，levD突變體在存在果糖或甘露糖的情況下生長比DL1慢，這表明LevDEFG在這些己糖的轉運中起作用。當在葡萄糖中生長時，野生型菌株和levD突變體之間的倍增時間沒有顯著差異。
為了驗證ManL和LevD在糖轉運中的作用，將DL1以及manL和levD突變體在含有0.5%葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖的TV中進行厭氧培養(yǎng)。在指數(shù)中期收集細胞，并分別使用葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖作為底物測量PTS比活性。與DL1菌株相比，manL突變體對葡萄糖、甘露糖和半乳糖的PTS活性顯著降低，但對果糖的活性略有增加。levD突變體對果糖的PTS活性顯著降低，對葡萄糖的活性顯著升高，而對甘露糖和半乳糖的PTS活性變化很?。▓D2）。這些結果進一步支持ManL參與葡萄糖、半乳糖和甘露糖的轉運，并且可能也參與果糖的利用，而LevD似乎主要負責果糖的內(nèi)化。
戈登氏鏈球菌fruA和levD基因的CCR。我們研究了fruA和levD的表達在轉錄水平上如何響應不同的碳水化合物進行調節(jié)。通過將含有fruA或levD啟動子的DNA片段融合到整合載體上的無啟動子cat基因，并將啟動子融合以單拷貝形式建立在戈登氏鏈球菌染色體上的一個遠端位點，構建了PfruA-cat和PlevD-cat融合體。用基因融合構建體轉化DL1菌株，所得菌株在含有0.5%的葡萄糖、果糖、半乳糖或菊粉，或菊粉與葡萄糖、果糖或半乳糖組合的TV培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后進行CAT測定。如表2所示，當細胞在菊粉上生長時，fruA和levD啟動子的活性最佳，但當細胞在偏好的碳水化合物葡萄糖或果糖上生長時較低。在含有菊粉和葡萄糖、半乳糖或果糖組合的細胞生長中，這些啟動子融合的表達也受到抑制。因此，與變形鏈球菌中的同源系統(tǒng)相似，fruA和levD的轉錄可由果聚糖聚合物誘導，并在存在偏好碳水化合物時被抑制。值得注意的是，CCR在含有果糖的培養(yǎng)物中最明顯，而變形鏈球菌中fruA的CCR由葡萄糖最有效地引發(fā)。同樣值得注意的是，半乳糖引起fruA表達的明顯抑制，但半乳糖在變形鏈球菌中基本上是一種非抑制性碳水化合物。
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