2.5 HRB2019株的增殖與鑒定
CRFK細胞在接種HRB2019株后的24 h開始出現(xiàn)細胞圓縮、聚集、空斑等的皰疹病毒感染導致的典型細胞病變，測得HRB2019株的病毒滴度為1×108.43 TCID50·mL-1。電鏡觀察CRFK細胞感染HRB2019株的超離后產(chǎn)物，可見明顯的皰疹病毒典型形態(tài)的病毒粒子，成球形、有囊膜、直徑約為200 nm；以FHV-1貓源陽性血清為一抗，F(xiàn)ITC標記的山羊抗貓IgG為二抗，對分離病毒株進行IFA鑒定，結(jié)果顯示，感染HRB2019株的CRFK出現(xiàn)特異性綠色熒光，對照組正常CRFK細胞無熒光；以MOI為0.01的HRB2019株感染CRFK細胞，每隔12 h取細胞上清進行病毒含量檢測，繪制的生長曲線顯示，病毒接種細胞后12 h開始復制，12~36 h快速增殖，48~72 h進入增殖平臺期且滴度達到高峰，84 h病毒滴度開始下降(圖4)。
A.HRB2019分離株電鏡觀察結(jié)果。B.HRB2019分離株的IFA鑒定結(jié)果(200×):a.感染HRB2019株的CRFK細胞；b.正常CRFK細胞。C.HRB2019分離株生長動力曲線
圖4 HRB2019株鑒定結(jié)果
2.6 HRB2019株基因序列分析
將HRB2019株與國內(nèi)外流行的FHV-1毒株gD基因核酸序列進行核苷酸同源性及遺傳進化分析，結(jié)果顯示，HRB2019株(▲表示)與GenBank收錄的國內(nèi)外貓源FHV-1流行株核苷酸同源性100%，但與一株虎源的廣東分離株親緣關系較遠(KJ466150)，核苷酸同源性為99.8%，說明FHV-1的宿主特異性較高(圖5)。
圖5 HRB2019分離株gD基因系統(tǒng)進化樹
3討論
目前，我國是僅次于美國的寵物犬、貓飼養(yǎng)大國，犬、貓數(shù)量位居全球第二。引起貓上呼吸道感染綜合征的主要病原微生物包括FHV-1、FCV、衣原體、支氣管敗血性博代氏桿菌、支原體、呼腸孤病毒等。其中，由FHV-1、FCV引起的病毒性感染占上呼吸道綜合征總發(fā)病率的85%以上，F(xiàn)HV-1和FCV混合感染也十分常見。牛昊巖等對2018—2019年南京市2 249例寵物貓病例的調(diào)查統(tǒng)計顯示，傳染病占總病例數(shù)的14.32%，最常見的為上呼吸道感染，其中，F(xiàn)HV-1和FCV的混合感染占總數(shù)的8.33%；李麗景在2020—2021年對西南部分地區(qū)FHV-1和FCV的感染情況進行了分子流行病學調(diào)查，183份發(fā)病貓拭子樣本中FHV-1、FCV混合感染率為10.14%。由此可見，F(xiàn)HV-1和FCV的混合感染在貓上呼吸道病中的比例極高，加之寵物醫(yī)院所使用的診斷試劑在準確性、敏感性等存在不足，常常造成漏診的現(xiàn)象，給貓上呼吸道病的診斷和防治帶來巨大的挑戰(zhàn)。
本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV與FHV-1相比，存在明顯的生長優(yōu)勢，有FCV存在時，細胞病變速度快、病毒滴度高，會抑制FHV-1在細胞上的復制與增殖，且FCV病毒滴度遠高于FHV-1。研究中筆者嘗試用雞胚尿囊膜途徑接種病毒、siRNA體外干擾、噬斑純化、紅細胞凝集特性、差異化細胞培養(yǎng)等方法分離FCV與FHV-1，均以失敗告終。FCV病毒本身具有高變異的特性，抗血清對非親本毒株不能表現(xiàn)完全中和活性。故本研究先利用FCV的生長優(yōu)勢分離出FCV，并制備其特異性抗血清，通過血清中和試驗摸索能完全中和FCV且FHV-1能病變的血清中和條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病毒稀釋倍數(shù)較低的A、B組，F(xiàn)CV抗血清不能完全中和FCV，依然表現(xiàn)為FCV和FHV共存，且FCV具有壓倒性生長優(yōu)勢而不能分離出FHV-1；而D組在病毒高稀釋倍數(shù)條件下，F(xiàn)CV和FHV-1含量過低，其中的FCV被其抗血清完全中和，而FHV-1的含量不足以感染足夠數(shù)量的細胞發(fā)生肉眼可見的病變。最終摸索出最佳血清中和條件為C組，即FCV抗血清與混合毒體積比為8∶1，從而成功中和FCV并分離出FHV-1。在已有的貓呼吸道病原分離鑒定的研究報道中，部分研究者習慣于將病料先接種細胞增殖培養(yǎng)后再進行病原鑒定，這很容易造成無生長優(yōu)勢的病原在培養(yǎng)過程中丟失。按照本研究的病毒分離方法可以很大程度避免在分離混合感染病料時對FHV-1的漏檢，提高了FHV-1的分離率，為了解FHV-1的真實感染情況提供了理論依據(jù)，為眾多動物疫病混合感染的研究提供了技術(shù)支撐。
當前國內(nèi)使用的貓鼻氣管炎、杯狀病毒、泛白細胞減少癥的三聯(lián)疫苗仍為上世紀80年代研制的進口疫苗，國產(chǎn)貓疫苗還處于研發(fā)階段，因此對貓群中主要傳染性病原的分離與研究是重中之重。本文建立的FHV-1、FCV混合感染病毒的分離方法，為FHV-1及FCV的分離提供了新思路，對加快FHV-1病原學、疫苗學、分子生物學研究的步伐起到重要作用，為我國貓疫苗的開發(fā)的研究奠定了基礎。
4結(jié)論
本研究利用血清中和試驗從FCV、FHV-1混合感染的病貓拭子中分離出1株FHV-1，經(jīng)形態(tài)學觀察、體外培養(yǎng)特性鑒定及gD基因的遺傳進化分析，確認該毒株為FHV-1，并命名為HRB2019株。