摘要：采集哈爾濱某貓舍中表現(xiàn)為上呼吸道感染的患病貓眼、鼻拭子，PCR初步確診為貓杯狀病毒（FCV）和貓皰疹病毒（FHV-1）混合感染。利用貓腎細胞（CRFK）對樣本進行病毒分離，前兩代細胞培養(yǎng)物的核酸檢測結(jié)果為FHV-1和FCV陽性，第三代開始只有FCV陽性，由此分離出FCV。制備此株FCV的鼠源多克隆抗體，并中和混合培養(yǎng)物中的FCV，從而分離出FHV-1，命名為HRB2019株。通過病毒粒子形態(tài)觀察、間接免疫熒光試驗（IFA）和基因序列分析等方法鑒定HRB2019株，并研究其體外生長動力學。結(jié)果顯示，HRB2019株可在CRFK細胞上產(chǎn)生典型病變，測得其第四代病毒滴度為1×108.43TCID50·mL-1；電鏡下可觀察到球形、有囊膜、直徑約為200 nm的病毒粒子；IFA結(jié)果顯示，分離株可與FHV-1陽性血清結(jié)合，出現(xiàn)特異性熒光；擴增分離株的gD基因，其與國內(nèi)外流行株高度同源。病毒一步生長曲線表明，HRB2019株感染細胞12 h后開始復制增殖，12~36 h為快速增殖期，48~72 h進入增殖平臺期且滴度達到高峰，84 h病毒滴度開始下降。本研究首次從FCV與FHV-1混合感染的病料中成功分離出FHV-1，為FHV-1的流行病學調(diào)查和病原學研究提供了重要數(shù)據(jù)，為混合感染中生長弱勢毒株的分離提供了方法學依據(jù)。
貓皰疹病毒1型(feline herpesvirus type-1,FHV-1)和貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)是引發(fā)貓上呼吸道感染的主要病原。FHV-1屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科成員，是有囊膜的雙股DNA病毒，只有一個血清型。FHV-1引起的貓科動物上呼吸道急性高度接觸性傳染病也被稱作貓傳染性鼻氣管炎，該病發(fā)病率極高，成年貓和幼貓均易感，尤其是幼貓，感染后可引起死亡。臨床上以噴嚏、角膜結(jié)膜炎、嗜睡及精神沉郁等為主要特征。FCV為杯狀病毒科，水皰疹病毒屬成員。FCV在貓群中廣泛分布，多感染幼齡貓，感染后引起的臨床癥狀為口腔潰瘍、急性呼吸道疾病、鼻炎、跛行、肺炎等。由于FHV-1、FCV感染引起的臨床癥狀相似，故很難通過臨床診斷確診，通常需要實驗室分子生物學方法進行鑒別診斷。
同時,FHV-1常與FCV混合感染，因兩種病毒增殖速度差異巨大，給病原的分離鑒定帶來極大的困難。本研究曾嘗試多種方法從FHV-1和FCV混合感染的臨床病料中分離兩種病毒均以失敗告終后，最終采用血清中和方法成功分離出FHV-1，并對其生物學特性進行鑒定。目前國內(nèi)外尚未見從FHV-1和FCV混合感染的臨床病料中分離兩種病毒的報道，因此本研究為FHV-1流行株的分離、鑒定提供了有效方案，豐富了FHV-1的流行病學及病原學數(shù)據(jù)，為貓上呼吸道疾病的診斷、治療和防控提供必要的技術(shù)支撐。
1材料與方法
1.1病料與細胞
眼、鼻拭子取自哈爾濱某貓舍患上呼吸道感染的病貓，臨床表現(xiàn)為噴嚏、食欲不振、眼鼻分泌物多、嚴重結(jié)膜炎；貓腎細胞(CRFK)由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所自然疫源性人獸共患病創(chuàng)新團隊保存；昆明鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。
1.2主要試劑和儀器
病毒核酸(DNA/RNA)提取試劑盒購自AXYGEN公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自TaKaRa公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%Trypsin-EDTA購自Gibco公司；2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)購自Vazyme公司；DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；NaRedⅡ核酸染料購自北京派拓科技有限公司；QuickAntibody-Mouse5 W佐劑購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；FITC標記羊抗鼠IgG購自Sigma公司；FITC標記的山羊抗貓IgG購自Jackson ImmunoResearch公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega生物公司；FHV-1 HR-1株及其貓源陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所自然疫源性人獸共患病創(chuàng)新團隊保存；PCR儀購自博日科技有限公司；DYY-6D電泳儀電源購自北京六一生物科技有限公司；倒置熒光顯微鏡購自Nikon公司。
1.3病料PCR/RT-PCR檢測
利用AxyPrep病毒核酸提取試劑盒提取病料拭子核酸，分別用FHV-1、FCV、貓衣原體(chlamydophila felis,C felis)的特異性鑒定引物進行檢測，引物序列見表1，由庫美生物科技有限公司合成。FCV的反轉(zhuǎn)錄體系及程序參照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說明書。FHV-1、FCV和C felis的PCR擴增體系為：2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)10μL，ddH2O 6μL，上、下游引物各1μL，模板2μL，共20μL。PCR擴增程序為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
表1引物序列信息
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