1.2.2噬菌體的電鏡觀察參照J(rèn)ohnson等的研究方法對純化后的根瘤菌噬菌體進(jìn)行電鏡觀察，取濃縮后10μL的噬菌體溶液滴在銅網(wǎng)上沉淀20min,用濾紙片于銅網(wǎng)的側(cè)面將液體小心吸出。隨
后將吸干的銅網(wǎng)浸入到10μL磷鎢酸（0.2%，PTA）中，對噬菌體染色10s.用干凈的濾紙片吸去多余的PTA染色液后，將干燥后的銅網(wǎng)用透射電子顯微鏡（JEM-1400,JEOL）進(jìn)行噬菌體的電鏡觀察。
1.2.3噬菌體的效價（滴度）測定噬菌體效價是指每毫升樣品中含有具有侵染活性的噬菌體粒子數(shù)，又稱噬菌斑形成單位數(shù)（plaque-forming unit,PFU）。噬菌體的效價參照Gu等的方法進(jìn)行：將純化后的噬菌體用SM緩沖液做10倍連續(xù)稀釋后，每個稀釋度取100μL,分別加入到含有200μL根瘤菌宿主液的試管中，采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法培養(yǎng)噬菌體，計算噬菌斑個數(shù)。試驗做3次重復(fù)，噬菌體效價的計算取其平均值。選取30——300個噬菌斑的平板用以計算每毫升未稀釋原液的噬菌體數(shù)（噬菌體效價）。噬菌體效價（PFU·mL-1）=平板上的噬菌斑數(shù)/所取樣品體積x稀釋倍數(shù)。
1.2.4噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)測定噬菌體在感染初期時，顆粒數(shù)與潛在的細(xì)菌宿主細(xì)胞數(shù)目的比值即為MOI感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）。參考Lu等研究方法進(jìn)行根瘤菌噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測定，按照不同的噬菌體稀釋比例（100、10、1、0.1、0.01和0.001）與生長至對數(shù)生長期的根瘤菌混勻后，靜置20min，室溫下200r·min-1振蕩培養(yǎng)4h,10000xg4℃離心20min后，上清懸液過0.22μm濾膜。取過濾的噬菌體液采用雙層平板法測定其滴度，試驗重復(fù)4次，取平均值計算噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)。
1.2.5噬菌體的一步生長曲線參考Weiss等的方法進(jìn)行噬菌體一步生長曲線的測定，將處于對數(shù)生長期的根瘤菌宿主菌按照相應(yīng)的最佳感染復(fù)數(shù)比例與噬菌體混合，室溫條件下培養(yǎng)30min，12000 r·min-1離心30s后棄掉上清液，用預(yù)先配置好的YMA液體培養(yǎng)基連續(xù)洗滌菌體沉淀2次，隨即利用5mL液體的YMA培養(yǎng)基懸起沉淀后混勻，迅速放入搖床中28℃進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，從放置起開始計時，每間隔10min取出100μL混合液，進(jìn)行倍比稀釋后，按照1.2.3的方法進(jìn)行效價的測定。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，根瘤菌噬菌體效價的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一步生長曲線的繪制，用以計算噬菌體的潛伏期、裂解期和裂解量等生物學(xué)特性，其中裂解量的計算公式為：裂解量=裂解末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度。
1.2.6噬菌體對溫度、pH和紫外光敏感性測定參考Ji等研究方法進(jìn)行噬菌體熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的測定，取噬菌體液1.0mL于無菌EP管中，分別于不同溫度（30、40、50、60、70和80℃）下水浴1h,之后取出并立即置于冰浴中冷卻，測定其在不同溫度條件下的效價。
pH穩(wěn)定性測試步驟為：取20μL的噬菌體原液，加入到0.98mL的YMA液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下孵育1h.將混合物的pH值用不同緩沖液調(diào)至pH3.0——11.0.所用到的緩沖溶液主要包括：50 mmol·L-1檸檬酸緩沖（pH3.0——5.0）、磷酸鹽緩沖液（pH6.0——8.0）、Tris-鹽酸緩沖液（pH9.0）和碳酸緩沖液（pH10.0——11.0），按照1.2.3的方法進(jìn)行效價的測定，試驗設(shè)置3個重復(fù)樣本。
噬菌體對紫外光敏感性測定方法：取15mL噬菌體原液于直徑6cm的滅菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈（20W,30cm）下，分別處理0、3、6、9、12、15、18和21min,每次取樣1mL,然后靜置在暗處30min,按照1.2.3的方法測定其效價，并計算其存活率。
1.3數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Sigma Plot12.5進(jìn)行繪圖。
2結(jié)果與分析
2.1根瘤菌噬菌體的分離與純化及形態(tài)學(xué)鑒定
本研究以慢生根瘤菌（USDA110T）、中華根瘤菌（CCBAU05684T）和中華苜蓿根瘤菌（USDA1002T）為宿主，采用雙層平板法，分離獲得9株根瘤菌噬菌體，其噬菌斑均呈圓形分布、表面清晰透明、邊緣光滑平整、沒有同心圓噬菌斑的現(xiàn)象（圖1）。通過噬菌斑特征鑒定，9株噬菌體均為裂性噬菌體。依據(jù)不同宿主分別命名為SMM-1、SMM-2、SMM-3、SSS-1、SSS-2、SSS-3和BDM-1、BDM-2、BDM-3.純化后的噬菌體經(jīng)負(fù)染后，電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)及噬菌體特征如圖1所示。獲得的3株苜蓿根瘤菌噬菌體（SMM）和3株慢生型根瘤菌噬菌體（BDM）均為蝌蚪狀，頭部呈二十面體立體結(jié)構(gòu)，帶有可伸縮無彎曲的長尾。其頭部大小范圍為（71±8）——（86±5）nm,尾部大小在（86±5）——（111±7）nm范圍內(nèi)（表1）。而中華根瘤菌噬菌體（SSS）頭部形態(tài)近乎于球形，尾部為一個非伸縮性且可彎曲的長尾。其頭部直徑明顯小于SMM和BDM,僅為（59±3）——（68±100）nm,而尾部長度為（208±15）——（236±25）nm,顯著高于SMM和BDM噬菌體。根據(jù)國際病毒分類委員會制定的分類標(biāo)準(zhǔn)，9株噬菌體都屬于有尾噬菌體目（Caudovirales），其中SMM和BDM屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae），而SSS屬于長尾噬菌體科（Siphovi-rideae）。
2.2根瘤菌噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)
獲得的噬菌體與相應(yīng)的根瘤宿主菌懸液按照不同稀釋比例混合后，9株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)分析結(jié)果顯示，SMM-1、SMM-2、SMM-3噬菌體和宿主菌懸液比值在0.1、0.01、0.001時的滴度達(dá)到最大值，分別為6.3x1010、9.6x1011和3.9x1011 PFU·mL-1;SSS-1、SSS-2、SSS-3分別在0.1、1和0.01的比例時其滴度達(dá)到最大值，分別為2.6x1010、9.5x 10°和3.6x1010°PFU·mL-1;而BDM-1、BDM-2、BDM-3分在0.1、0.01和1的比例時滴度達(dá)到最大值，分別為5.1x1011、3.5x1011和7.2x1011PFU·mL-1.研究發(fā)現(xiàn)，侵染相同宿主的噬菌體滴度達(dá)到最大時的最佳感染復(fù)數(shù)不同。
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